CHRONO-BMAL1通路对小鼠运动能力及骨骼肌糖和脂代谢相关指标的影响
作者单位：北京体育大学
会议名称：《第十三届全国体育科学大会》
会议日期：2023年
学科分类：0403[教育学-体育学] 040302[教育学-运动人体科学(可授教育学、理学、医学学位)] 04[教育学]
关 键 词：CHRONO BMAL1 骨骼肌 糖脂代谢 运动能力
摘 要：研究目的:有氧运动能力被认为是人类健康的重要生命体征。有氧运动能力低下可明显增加心血管疾病、全因死亡和其他各种慢病风险。同时,有氧运动能力也是运动员运动能力的重要基础,因此,深入探索其分子机制是运动科学领域备受关注的课题。有氧运动能力不仅与心肺、循环系统功能有关,而且与骨骼肌利用氧的能力关系密切。骨骼肌作为机体重要的动力源,其糖、脂氧化供能是运动的主要能量来源,故骨骼肌糖、脂代谢水平也是影响有氧运动能力的重要因素,但其机制仍亟待阐明。骨骼肌糖代谢水平除了受遗传、营养、运动等因素的影响外,也受骨骼肌生物钟的调节。脑和肌肉芳香烃受体转位蛋白样蛋白1(Brain and muscle ARNT-like protein 1,BMAL1)是核心生物钟分子,也是一个重要的转录因子,它可与靶基因启动子上的E-box区域结合,促进后者的转录。BMAL1的靶基因主要与生物节律和能量代谢相关,故其在调控骨骼肌能量代谢方面具有重要的作用。昼夜节律相关的转录抑制因子Chrono(Computationally Highlighted Repressor of Network Oscillator,也称Gm129,Ciart,C1orf51等)是近年新发现的生物钟基因,已有研究表明CHRONO蛋白能够直接与转录因子BMAL1结合,并反馈性地抑制BMAL1的活性。因此,CHRONO蛋白被认为是BMAL1的转录抑制因子,CHRONO-BMAL1通路是调控生物节律的重要通路。那么,CHRONO-BMAL1通路是否也参与骨骼肌中糖、脂代谢的调控,进而影响机体的运动能力?目前的研究并没有得出明确的结论。为了避免Chrono基因过表达在生长发育过程中造成代偿作用,本研究使用他莫昔芬(Tamoxifen)诱导的骨骼肌特异性Chrono过表达小鼠。在其成年后诱导形成骨骼肌特异性Chrono过表达小鼠,探讨CHRONO-BMAL1通路对骨骼肌糖、脂代谢相关mRNA表达以及运动能力的影响,以寻找调控运动能力的分子靶点。研究方法:通过CRISPR-Cas9技术用C57BL/6J小鼠的ES细胞产生了Chronoflox/flox过表达鼠:其在小鼠H11位点敲入了CAG启动的Chrono基因,并在CAG启动子与Chrono基因之间插入了flox标记的终止密码子。通过将Chronoflox/flox小鼠与携带由骨骼肌特异性α-actin(ACTA1)启动子和雌激素受体的配体结合区突变体(ERT2)驱动的Cre重组酶基因(ACAT1-Cre ERT2)小鼠进行繁殖,产生了可诱导的骨骼肌特异性Chrono过表达(iMS-Chrono TG,ims TG)小鼠。随后,采用可诱导的骨骼肌特异性Chrono过表达鼠和Cre工具(ACAT1-Cre ERT2)鼠,在其满8周后分别腹腔注射他莫昔芬,制备为骨骼肌特异性Chrono过表达(ims TG)鼠和对照(Ctrl)鼠。对两种鼠的最大运动能力和运动耐力进行测定。其中,最大运动能力测试方案是参照Brunch等的研究并稍加进行了改良。该方案主要使用逐级递增运动负荷,以反映小鼠糖酵解供能为主的极限状态下的运动能力。具体方案如下:小鼠跑台坡度设定为5度,初始的速度设置为米/分钟,时间持续5分钟;之后每三分钟增加3米/分钟的跑速,小鼠置于跑台上运动直至力竭。运动耐力的测试方案是参照Michel等人的研究。该方案主要在禁食五小时状态下,使用长时间中等强度、低递增负荷的运动方式,以反映糖和脂肪有氧氧化供能为主的状态下的运动能力。具体方案如下:在进行运动耐力测试的当天早上八点移除食物,在下午一点准时开始测试。小鼠跑台设定为坡度设定为10度,初始速度设置为10.2米/分钟,持续30分钟。随后以12.6米/分钟的速度运动15分钟;以15米/分钟的速度运动15分钟;以17.4米/分钟的速度运动15分钟;以19.8米/分钟速度运动15分钟;以22.2米/分钟速度运动直至小鼠力竭。两种测试方案的力竭判断标准均为:小鼠不能维持现有跑速继续运动并且机械刺激和电刺激小鼠十秒以上仍不能继续运动。随后记录运动至力竭的时间,并计算运动距离。小鼠处死后通过Western Blot检测细胞核中CHRONO蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测骨骼肌中Chrono以及糖代谢相关基因:己糖激酶(Hk2)、磷酸果糖激酶(Pfkm)、丙酮酸脱氢酶α亚基1(Phka1)、丙酮酸脱氢酶磷酸酶催化亚基1(Pdp1)和丙酮酸脱氢酶激酶4(Pdk4)的mRNA表达情况和脂代谢相关基因:过氧化物酶体增殖物活化受体α(Pparα)、过氧化物酶体增殖物活化受体δ(Pparδ)、中链酰基辅酶A脱氢酶(Mcad)、短链酰基辅酶A脱氢酶(Scad)、羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物α亚基(Hadhα)、羟酰辅酶A