家蚕质型多角体病毒编码的miRNA BmCPV-miR-1和BmCPV-miR-3的鉴定及功能研究
作者单位：江苏科技大学生物技术学院 中国农业科学院蚕业研究所
会议名称：《中国蚕学会2021年学术年会》
会议日期：2021年
关 键 词：家蚕质型多角体病毒 miRNA 靶基因 GTP结合核蛋白Ran
摘 要：家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,BmCPV）是家蚕的主要病原之一,其基因组为十个片段双链RNA。关于BmCPV感染家蚕的致病机理目前仍不是很清楚。研究表明,在病毒感染宿主和免疫逃逸过程中,由病毒编码的mi RNA发挥重要作用,因此,研究BmCPV编码的mi RNA有助于阐明BmCPV与宿主家蚕之间的相互作用机制。我们在前期工作中,采用BmCPV敏感型家蚕品种4008经口接种BmCPV多角体,于接种后72小时解剖取中肠,进行小RNA深度测序,筛选获得若干条由BmCPV基因组编码的候选mi RNAs,并采用生物信息学方法进行了靶基因预测。本文选取其中的两条候选mi RNA进行研究,即由BmCPV基因组第一片段编码的BmCPV-miR-1和由第三片段编码的BmCPV-miR-3,茎环RT-PCR在BmCPV感染的中肠可分别检测到两条miRNA的特异性条带,而且q RT-PCR检测结果表明这两个mi RNA在病毒感染的中肠中随时间增加表达量逐渐上升。采用mi Randa和targetscan两种靶基因预测软件筛选出家蚕GTP结合核蛋白Ran（GTP-binding nuclear protein Ran,BmRan）为这两个mi RNA的共同靶基因,靶位点均位于该靶基因m RNA序列的3’UTR区域。q RT-PCR定量结果表明BmRan基因的表达量随着感染时间增加而呈现下调表达。分别构建了BmCPV-miR-1、BmCPV-miR-3和BmRan的慢病毒表达载体,连同三个包装质粒共转染293T细胞,于转染后24h、48h收集细胞提取总RNA,q RT-PCR检测BmRan基因的表达量,结果表明BmCPV-miR-1和Bm CPV-miR-3均能下调BmRan基因的表达,并且两个mi RNA对调靶基因表达的负调控作用具有累加效应。进一步化学合成了两个mi RNA的mimics和NC（negativecontrol,阴性对照）分别转染BmN细胞,于转染后24h、48h和72h采用q RT-PCR检测靶基因Bm Ran的表达量,结果表明两个mi RNA的mimics均能下调靶基因的表达,且同时转染两个mi RNA的mimics的细胞中靶基因的下调表达更为明显,进一步证明BmCPV-miR-1和BmCPV-miR-3对BmRan基因的表达起负调控作用,且两个mi RNA共同作用时的抑制效果比单个mi RNA分别作用时更强。为证明两个mi RNA在家蚕体内对靶基因的调控作用,将合成的miRNA mimics、inhibitor和NC对蚕体进行体腔注射,于注射后不同时间点取中肠,提取总RNA反转录,q RT-PCR检测BmRan基因的表达变化,结果表明BmCPV-miR-1和BmCPV-miR-3均能够负调控靶基因BmRan的表达。进一步将合成的mi RNA mimics、inhibitor和NC对病毒感染的家蚕五龄幼虫进行体腔注射,于注射后不同时间点q RT-PCR检测病毒基因组RNA第二、第五和第十片段的复制水平,结果显示,病毒基因组三个片段的复制水平随着感染进展逐渐上升,但与NC注射组相比较,mimics注射组三个基因组片段的复制水平上升更快,而inhibitor注射组三个基因组片段的复制水平明显低于NC注射组。由此推测BmCPV-miR-1和BmCPV-miR-3可能通过抑制靶基因BmRan的表达促进病毒的复制。GTP结合核蛋白Ran是一个转运蛋白,参与细胞mi RNA前体（pre-miRNA）由细胞核向细胞质的转运,而宿主的某些mi RNA是宿主抵御病毒感染的重要机制。因此,BmCPV-miR-1和BmCPV-miR-3结合于靶基因BmRan m RNA的3’UTR区域,负调控BmRan基因的表达,抑制宿主细胞核内pre-mi RNA向细胞质的转运,减少了宿主mi RNA的生成,为BmCPV的复制创造了有利的细胞内环境,促进了病毒的复制。关于BmCPV-miR-1和BmCPV-miR-3在BmCPV感染家蚕过程中的具体作用机制仍需要深入研究。