家蚕质型多角体病毒编码的BmCPV-miR-10的鉴定和功能研究
作者单位：江苏科技大学生物技术学院 中国农业科学院蚕业研究所
会议名称：《2019年全国蚕病理学与病虫害防控学术研讨会》
会议日期：2019年
关 键 词：家蚕质型多角体病毒 miRNA 靶基因 家蚕细胞凋亡抑制因子
摘 要：家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cypovirus,BmCPV）是家蚕的重要病原之一,也是典型的RNA病毒,其在侵染过程中与家蚕免疫防御系统的互作机制尚不清楚。研究发现,一些病毒编码的mi RNA在病毒感染宿主和免疫逃逸过程中发挥重要作用,但关于昆虫病毒尤其是RNA病毒编码的miRNA及其功能的报道很少。因此,研究BmCPV基因组编码的功能性mi RNAs,揭示其在病原-宿主互作过程中的功能,将为miRNA家族增加一类新的由RNA病毒编码的miRNA分子,还将揭示一种由miRNA介导的RNA病毒在家蚕组织细胞中复制增殖调控的新机制。为此,我们选择对BmCPV比较敏感的家蚕品系4008为实验材料,经口接种BmCPV多角体,分别抽提感染组和对照组家蚕中肠的总RNA,进行小RNA深度测序,筛选病毒特异表达的miRNAs,并预测其靶基因,验证mi RNA对靶基因的调控作用及其对BmCPV复制增殖的影响。通过小RNA深度测序数据和生物信息学分析,并经茎环RT-PCR鉴定,鉴定得到8条可能由BmCPV基因组编码的miRNAs;采用miRanda和targetscan两种靶基因预测软件分别针对家蚕基因组进行靶基因预测,并对靶基因进行GO和Pathway分析,发现它们的功能涉及Apoptosis,Cell cycle,RNA degradation, PPAR signaling pathway,Nucleotide excision repair等通路。本研究选取其中一条miRNA即BmCPV-miR-10进行深入研究,qRT-PCR结果表明BmCPV-miR-10在感染BmCPV的家蚕中肠组织中随感染时间增加呈上调表达模式;软件预测发现,RISC-loading complex（RLC） subunit TARBP2基因和家蚕细胞凋亡相关因子p53-associated parkin-like cytoplasmic protein（PARC）为BmCPV-miR-10的两个候选靶基因,靶位点分别位于BmPARC mRNA序列的CDS区域和BmRLC submit TARBP2 m RNA序列的3’UTR区域。qRT-PCR检测结果表明,随感染时间增加,BmPARC基因和BmRLC submit TARBP2基因先上调后下调表达。分别构建BmCPV-miR-10和BmPARC和BmRLC submit TARBP2的慢病毒表达载体,共转染293T细胞,通过qRT-PCR检测BmPARC基因和BmRLC submit TARBP2基因的表达水平;进而合成了BmCPV-miR-10的mimic和inhibitor分别转染家蚕培养细胞并注射于蚕体,从而检测两个靶基因以及病毒的表达趋势,验证对病毒复制的影响。根据初步结果推测,BmCPV在侵染家蚕的过程中,可能通过BmCPV-miR-10下调BmPARC基因和BmRLC submit TARBP2基因的表达水平,进而抑制宿主细胞凋亡的发生,以利于病毒自身的繁殖。