基于氟亲和作用力芯片与MALDI-TOF质谱技术测定酶活性
作者单位：南京大学生命分析化学国家重点实验室
会议名称：《第三届全国质谱分析学术报告会》
会议日期：2017年
学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学]
摘 要：质谱技术由于具有高通量和免标记的优势,被广泛应用于酶活性分析测定。为简化样品前处理过程,在前期工作基础上[1,2],我们设计了氟亲和作用力芯片,结合MALDI-TOF质谱技术测定酶活性。该工作以天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-3为模型,将其多肽底物与―氟标签分子‖连接并通过氟-氟相互作用组装于氟修饰玻片表面,制备出用于酶活性检测的芯片。氟-氟相互作用不仅保证了底物的高效组装,同时可有效减少非特异性吸附,提高分析灵敏度。在目标酶的作用下,底物被剪切产生质量位移,则酶活性可通过其质谱图酶切产物直观反应出来（图1）。繁琐的生物样品前处理过程在一定程度上限制了生物检测技术的发展,因此本文提出了检测蛋白酶的新平台。将末端带有半胱氨酸的多肽与连接―氟标签分子‖的马来酰亚胺进行混合,巯基与马来酰亚胺的Michael加成反应具有点击反应的特性,修饰多肽效率高,反应快;反应产物与修饰有氟疏水长链的ITO玻璃片进行孵育,通过氟-氟疏水相互作用将多肽固定在导电玻璃上;酶底物多肽在―智能芯片‖上形成微阵列,在底物的阵列位点上进行酶反应,便可以得到酶切的信息。我们选择了与细胞凋亡过程相关的酶天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-3作为模型,通过质谱检测得到的质量位移可以判断酶反应位点,而酶活性则可通过质谱图中酶反应产物与底物多肽的相对关系直观反映出来。为实现高通量的酶活性测定和获得更为直观的分析结果,我们设计了一个生物质谱芯片,通过氟-氟相互作用来特异性吸附天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-3底物肽段,这个自组装过程便捷高效,利用该方法测定酶简单,方便,灵敏,避免了非特异性的吸附,无需复杂的样品的预处理,只需简单的冲洗便可以进行生物质谱的检测。利用质谱检测,无需对生物样品进行标记,防止了标记物对生物过程的影响,对待测物质的分子量和丰度的检测便可以得到想要的信息。另外,生物芯片上的一系列点形成阵列,可以同时测定不同浓度,不同物质的信息,是一种高通量的检测方法。此方法简单可靠还具有通用性,可方便地扩展应用于其它酶系统,为探究更多过程中酶的作用机制提供了新途径,在生命分析领域具有潜在的应用价值。