Qβ RNA复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响
作者单位：江南大学生物工程学院教育部重点实验室 Department of BiotechnologyGraduate School of EngineeringOsaka University
会议名称：《第四届中国酶工程学术交流讨论会》
会议日期：2003年
学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术]
摘 要：Qβ复制酶是来自于Qβ噬菌体的以RNA为模板的RNA聚合酶[1],常用于体外RNA和蛋白质分子的合成以及自复制系统的构建研究。该复制酶由四个亚基组成,分别为α,β,γ和6亚基,其中只有β亚基是由病毒基因编码,而其他三个亚基都是宿主蛋白,通常与蛋白质合成有关[1]。Qβ复制酶对于体外RNA和蛋白质分子的合成及构建自复制系统的研究具有重要的应用价值[2],在这些系统的研究中均需要大量的Qβ复制酶。为提高Qβ复制酶全酶的产量,许多的研究者对此进行了大量的研究[3],虽然Qβ复制酶可利用多种表达载体在Ecoli中得到表达,但表达的β亚基几乎总是以不溶的形式存在,基本没有活性,从而限制了大量的可溶性Qβ复制酶的获得。由于Qβ复制酶的四个亚基摩尔比相等,除了β亚基,其他三个亚基是宿主蛋白质合成所必需的,由宿主***所合成,而且宿主细胞的核糖体蛋白S1与EF-Ts亚基的数量又比较低,β亚基的单独表达可能会引起其他亚基量的相对不足,从而影响Qβ复制酶全酶的溶解性及其活性。利用β亚基与其他三个亚基共表达可以了解是否宿主亚基的缺乏是引起Qβ复制酶不溶的主要因素,进而了解β亚基与其他三个亚基的共表达是否可能有助于可溶性Qβ复制酶的形成。本文对Qβ复制酶四个亚基的共表达进行了探索,利用pBAD质粒作为携带复制酶（rep）基因（β亚基）的载体,粒pET21a（+）（Novagen,Germany）作为S1,EF-Tu和Ts亚基的表达载体。将带有Sl,Ts,Tu,以及Ts-Tu基因的各个质粒分别转入到Ecoli中,得到的转化子再用pBAD33-rep转化。经限制性内切酶分析证实,各转化子分别含有pBAD33-rep与pET-S1,pET-Ts,pET-Tu或pET-Ts-Tu质粒的不同组合。经不同诱导物诱导后,复制酶β亚基可与其他亚基共表达,SDS-PAGE分析结果表明,只有当Ts,Tu与β亚基共表达时,复制酶β亚基的溶解性有一定的提高,且具有较高的活性。通过增强β亚基的表达,可溶性酶量得到相应提高。该研究对于利用亚基的共表达提高多亚基酶的溶解性和活性进行了尝试,对于提高融合蛋白的溶解性以及活性,特别是包含体蛋白的溶解性研究有一定帮助。