梅花鹿Col X基因的RNAi重组慢病毒载体的构建及鉴定
作者单位：江苏科技大学生物与环境工程学院 中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学省部共建实验室 特种经济动物种质资源遗传改良重点开放实验室
会议名称：《首届中国鹿业发展大会暨中国畜牧业协会鹿业分会成立大会》
会议日期：2010年
关 键 词：鹿茸 角柄 Col X基因 RNAi 慢病毒载体 微粒体培养
摘 要：研究十型胶原蛋白(Collagen type X,Col X),在软骨内成骨过程中所起的作用。本研究针对梅花鹿Col X基因设计筛选2条高分RNAi靶序列,在T4 DNA连接酶的作用下分别与慢病毒载体质粒plvthm连接,形成重组质粒S2-plvthm/S3-plvthm;PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。用Lipofectamine 2000介导S2-plvthm/S3-plvthm,pCMVdr8.91,pMD2G三质粒共转染293T细胞。结果显示:转染24小时后,观察到表达荧光蛋白的293T细胞。收集培养液后进行1000克离心力离心5分钟,所得上清液含有重组慢病毒的组分。S2-plvthm/S3-plvthm上清液中病毒滴度分别达到9.96×10TU/升和7.18×10TU/升。以此病毒感染梅花鹿角柄骨膜细胞,并进行微粒体培养,72小时后出现肉眼可见的白色微团,该细胞团有荧光表达。本试验成功地构建了针对梅花鹿Col X基因的慢病毒载体,为了研究Col X蛋白在鹿茸角骨化中的作用奠定了基础。