稻水象甲G蛋白α亚基基因的克隆、表达及其定位
作者单位：浙江大学农业与生物技术学院昆虫科学研究所、水稻生物学国家重点实验室
会议名称：《第二届全国生物入侵学术研讨会》
会议日期：2008年
学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治]
基 金：国家科技支撑计划课题(2006BAD08A14) 广东省科技计划项目(2004A20401002)) 农业部项目(农农植保字003号)
关 键 词：稻水象甲 Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel G蛋白α亚基
摘 要：异源三聚体G蛋白(Heterotrimeric G proteins),简称G蛋白,由α(38-52 kDa)、β(35 kDa)和γ(8-10 kDa)三个亚基构成,可以结合鸟苷三磷酸(GTP)和鸟苷二磷酸(GDP),并具有内在GTP酶活性,能水解GTP生成GDP。G蛋白在各类跨膜信号转导中以及细胞加工,包括膜囊泡转运、细胞骨架组装、细胞生长和蛋白合成中起着重要作用。G蛋白偶联信号传导系统是生物体内一类重要的细胞信号传导途径,在哺乳动物、简单真核生物、昆虫及植物中普遍存在。越来越多的研究证实G蛋白参与了昆虫的嗅觉、视觉和内分泌激素等多种信号的传导过程。根据已知的昆虫G蛋白序列,我们设计了简并引物,从入侵害虫稻水象甲Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel(Coleoptera:Curculionidae)孤雌生殖成虫头部的cDNA中克隆到了一个G蛋白α亚基—LoGoα,通过RACE得到了该基因的完整编码框,共有1067bp,推测其编码了353个氨基酸。与其它生物的G蛋白序列进行系统发育和比对分析,发现LoGoα属于G蛋白的Gi/o家族。该基因与其它Gi/o蛋白的主要功能区G1box、G2box、G3box、G4box和G5box,以及SwitchⅠ和SwitchⅡregions的氨基酸序列基本相同。这个保守的功能区主要是GTP结合及酶活性区,也是与Gβ和下游效应器的结合位点,因此我们推测LoGoα与其它生物G蛋白功能上是保守的。Realtime PCR分析发现LoGoα基因的mRNA在稻水象甲成虫的触角、头部(无触角)、胸部、腹部和足等不同的组织和卵、幼虫和蛹发育阶段都存在,说明在转录水平上,该基因在不同的发育时期和成虫的不同部位均有表达,触角中的表达量显著高于成虫的其它几个部位。将LoGoα连接到表达载体pET30进行原核表达,并通过调节不同的表达时间和IPTG浓度优化表达条件。pET30/LoGoα融合蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,将该蛋白大量表达后回收,免疫兔子,制备了LoGoα多克隆抗体。用LoGoα多克隆抗体进行Western blot实验,结果显示在成虫的触角、头部(无触角)、胸部、腹部和足等不同部位提取的总蛋白中均能检测到与目的蛋白大小相当的特异性条带,而在卵、幼虫和蛹时期则没有明显条带,推测LoGoα在卵、幼虫和蛹期只有转录水平上的表达而没有蛋白水平的表达。通过免疫胶体金标记的方法将LoGoα在触角进行免疫定位,结果显示在稻水象甲成虫触角上的不同类型感器中均能观察到金颗粒,说明LoGoα在触角的感器中广泛存在,推测该蛋白可能参与多种信号的跨膜传导过程。