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橡胶树膜系统酵母双杂交cDNA文库构建及HbSRPP7互作蛋白筛选

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热带作物学报 2023年第9期44卷 1735-1744页

作者：聂智毅康桂娟覃怀德曾日中中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101

橡胶树橡胶粒子上的蛋白质在橡胶生物合成一系列反应过程中起着关键作用,它们直接决定着橡胶烃分子的数量和大小,影响天然橡胶的产量和质量。小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,SRPP)是丰度仅次于橡胶延伸因子(rubber elong... 详细信息

橡胶树橡胶粒子上的蛋白质在橡胶生物合成一系列反应过程中起着关键作用,它们直接决定着橡胶烃分子的数量和大小,影响天然橡胶的产量和质量。小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,SRPP)是丰度仅次于橡胶延伸因子(rubber elongation factor,REF)的橡胶粒子蛋白组分,与橡胶粒子发育和橡胶生物合成密切相关。目前已知橡胶粒子上存在多种SRPP家族蛋白,但大部分成员的功能尚不清楚。SRPP可能通过与其他橡胶粒子蛋白相互作用发挥功能。为了筛选SRPP蛋白家族成员之一Hb SRPP7的互作蛋白,本研究利用位点特异性重组技术构建了原始库容为1.5×10^(7)CFU的均一化橡胶树胶乳膜蛋白酵母双杂交系统(membrane yeast two-hybrid system,MYTH)cDNA文库,该文库插入片段平均长度大于1500 bp,重组率约为100%。构建了用于MYTH系统筛选HbSRPP7互作蛋白的pBT3STE-SRPP7和pBT3SUC-SRPP7诱饵载体并确认其能在NMY32酵母菌株中正确表达,无自激活活性。使用pBT3STE-SRPP7诱饵质粒对胶乳MYTHcDNA文库进行筛选,获得21个HbSRPP7候选互作的蛋白,包括3个REF家族蛋白(HbREF1、HbREF3和HbREF8)、2个SRPP家族蛋白(HbSRPP1、HbSRPP2)、2个活性氧清除相关蛋白(thioredoxin H-type-like、L-ascorbate peroxidase 2)以及5个胁迫相关蛋白(high mobility group Bprotein 2-like、RPM1-interacting protein 4-like、stress-related protein-like、salt stress-induced hydrophobic peptide ESI3-like和F-box/kelch-repeat protein)。结果显示HbSRPP7除了可能通过与橡胶生物合成相关的橡胶粒子蛋白互作参与橡胶生物合成,也可能通过与生物和非生物逆境胁迫相关蛋白互作,响应橡胶树乳管生物和非生物逆境胁迫系统信号,参与橡胶粒子上的橡胶生物合成调控。该研究结果有助于了解SRPP家族蛋白的功能,为揭示橡胶粒子上参与橡胶生物合成的蛋白复合体组成,阐明橡胶生物合成及其调控的分子机制奠定基础。

关键词：橡胶树 HbSRPP7 膜蛋白酵母双杂交系统 cDNA文库互作蛋白

巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析

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基因组学与应用生物学 2014年第4期33卷 845-852页

作者：康桂娟黎瑜曾日中中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室和省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室儋州571737

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～... 详细信息

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。

关键词：巴西橡胶树NAC转录因子基因克隆表达分析转录激活活性

巴西橡胶树HbNTL1基因启动子的克隆与序列分析

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生物技术通报 2013年第1期29卷 83-88页

作者：康桂娟黎瑜曾日中聂智毅中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室和省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室儋州571737

膜结合NAC转录因子(NTLs)是植物NAC转录因子家族中一类C端具有跨膜结构域(transmembrane motifs,TMs)的转录调控因子,在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中具有重要的功能。根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)膜结合类NAC转录因子... 详细信息

膜结合NAC转录因子(NTLs)是植物NAC转录因子家族中一类C端具有跨膜结构域(transmembrane motifs,TMs)的转录调控因子,在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中具有重要的功能。根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)膜结合类NAC转录因子HbNTL1基因cDNA序列,利用基因组步移的方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbNTL1基因上游1 718 bp的调控片段。序列分析表明,该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点A位于起始密码子上游206 bp处。该启动子序列除了含有多个TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还存在赤霉素、茉莉酸和脱落酸等激素响应元件以及大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、W-box和MYCCONSENSUSATHSE等反应元件,表明HbNTL1转录因子可能是一个逆境胁迫相关NAC转录因子,在橡胶树抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要功能。

关键词：巴西橡胶树 HbNTL1启动子顺式调控元件逆境胁迫

巴西橡胶树HbNTL2基因的克隆和表达分析

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湖南农业大学学报（自然科学版） 2015年第6期41卷 602-609页

作者：康桂娟黎瑜曾日中中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室海南儋州571737

利用RT–PCR和实时荧光定量PCR技术,对巴西橡胶树膜结合转录因子Hb NTL2进行克隆和表达,并通过酵母试验进行转录激活功能分析。结果表明,Hb NTL2基因的开放阅读框为1 380 bp,编码一个由459个氨基酸组成的蛋白,该蛋白属于NAC转录因子家... 详细信息

利用RT–PCR和实时荧光定量PCR技术,对巴西橡胶树膜结合转录因子Hb NTL2进行克隆和表达,并通过酵母试验进行转录激活功能分析。结果表明,Hb NTL2基因的开放阅读框为1 380 bp,编码一个由459个氨基酸组成的蛋白,该蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC001亚族;在第6~172位氨基酸之间含有典型的NAC结构域,第433~453位氨基酸具有跨膜结构域,是膜结合NAC转录因子;Hb NTL2具有转录激活功能,转录激活区在C–末端;Hb NTL2在叶片的表达高于在橡胶树的其他部位,受割胶、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）处理以及低温胁迫诱导。综合分析结果表明,Hb NTL2可能参与调控巴西橡胶树的生长发育和胁迫应答过程。

关键词：巴西橡胶树膜结合NAC转录因子基因克隆基因表达转录激活活性

巴西橡胶树HbNAC24基因克隆和表达分析

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西北植物学报 2014年第12期34卷 2374-2381页

作者：康桂娟黎瑜曾日中中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室和省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室海南儋州571737

该研究以巴西橡胶树为实验材料,从橡胶树胶乳cDNA中克隆了NAC转录因子基因（HbNAC24）完整开放阅读框（ORF）,并通过酵母实验和实时荧光定量PCR技术,进行转录激活活性分析和表达分析.结果显示：（1）HbNAC24基因ORF为1 167 bp,编码388... 详细信息

该研究以巴西橡胶树为实验材料,从橡胶树胶乳cDNA中克隆了NAC转录因子基因（HbNAC24）完整开放阅读框（ORF）,并通过酵母实验和实时荧光定量PCR技术,进行转录激活活性分析和表达分析.结果显示：（1）HbNAC24基因ORF为1 167 bp,编码388个氨基酸,在N端第7～174氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域.（2）酵母实验表明,HbNAC24具有转录激活活性,转录激活区在高度变异C端,具备了NAC转录因子的基本特征.（3）序列比对和系统进化分析表明,HbNAC24蛋白属于NAC转录因子家族中的TIP亚族.（4）实时荧光定量PCR分析结果发现,HbNAC24基因在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶和茉莉酸（JA）处理均能够诱导HbNAC24表达上调.研究认为,HbNAC24基因可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程.

关键词：巴西橡胶树 NAC转录因子基因克隆表达分析转录激活活性

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巴西橡胶树HbNAM基因克隆和表达分析

南京林业大学学报（自然科学版） 2016年第1期40卷 59-64页

作者：康桂娟黎瑜曾日中中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室海南儋州571737

为了研究巴西橡胶树中植物特有NAC转录因子的功能,笔者通过RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对HbNAM的开放阅读框(ORF)进行了克隆和表达分析,并通过酵母转化实验进行转录激活活性分析。结果显示,HbNAM基因ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,在... 详细信息

为了研究巴西橡胶树中植物特有NAC转录因子的功能,笔者通过RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对HbNAM的开放阅读框(ORF)进行了克隆和表达分析,并通过酵母转化实验进行转录激活活性分析。结果显示,HbNAM基因ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,在第12—167位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,属于NAC转录因子家族中的NAM亚族。酵母试验表明,HbNAM在高度变异C端具有转录激活活性,具备转录因子的基本特征。实时荧光定量PCR分析发现,HbNAM在叶片、雄花、雌花、胶乳和树皮中均表达,其中以光合组织叶片和生殖组织雄花中的表达量最高,并且胶乳中该基因的表达受割胶、植物激素或植物生长调节剂茉莉酸(JA)和乙烯利(ET)以及低温胁迫影响,推测HbNAM可能与植物的生长发育和胁迫应答过程有关。

关键词：巴西橡胶树 NAC转录因子基因克隆表达分析转录激活活性

不同提取液对巴西橡胶树橡胶粒子蛋白质提取和分离的影响

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植物生理学报 2013年第10期49卷 1089-1098页

作者：代龙军黎瑜聂智毅康桂娟段翠芳曾日中中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地海南儋州571737

橡胶粒子是巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)乳管细胞内进行橡胶生物合成的亚细胞结构;对橡胶粒子的蛋白质组学研究,可为揭示天然橡胶生物合成机理提供线索。采用5种提取液分别提取橡胶粒子蛋白,并对橡胶粒子蛋白进行SDS-PAGE和16-BAC/SD... 详细信息

橡胶粒子是巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)乳管细胞内进行橡胶生物合成的亚细胞结构;对橡胶粒子的蛋白质组学研究,可为揭示天然橡胶生物合成机理提供线索。采用5种提取液分别提取橡胶粒子蛋白,并对橡胶粒子蛋白进行SDS-PAGE和16-BAC/SDS-PAGE电泳分离及MALDI TOF/TOF串联质谱分析,证明不同提取液抽提的橡胶粒子蛋白具有不同组成,发现分子量较高的橡胶延伸因子家族蛋白更难从橡胶粒子上被洗脱和提取。通过检索橡胶树转录组数据库,鉴定了3个新的橡胶粒子蛋白,即醌氧化还原酶、含蓖麻毒素B链凝集素结构域蛋白及枯萎/脱水相关蛋白。本研究建立的橡胶粒子蛋白质提取和分离方法,为进一步鉴定低丰度和具有重要功能的橡胶粒子蛋白提供了参照体系。

关键词：巴西橡胶树橡胶粒子蛋白质提取液

巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

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基因组学与应用生物学 2012年第5期31卷 447-454页

作者：康桂娟黎瑜夏可灿聂智毅曾日中中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学重点开放实验室省部共建国家重点实验室培育基地儋州571737 海南大学农学院海口570228

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Ge... 详细信息

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5'调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。

关键词：巴西橡胶树 HbNAC1启动子顺式调控元件逆境胁迫

酵母双杂交系统筛选新橡胶延长因子HbREF3互作蛋白

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基因组学与应用生物学 2016年第2期35卷 358-365页

作者：孙丽娜康桂娟黎瑜曾日中海南大学农学院海口570228 中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点开放实验室省部共建国家重点实验室培育基地儋州571737

橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)等橡胶粒子蛋白可能通过相互作用形成蛋白复合体在橡胶生物合成发挥作用。为鉴定REF家族中一新成员Hb REF3的互作蛋白,以橡胶树Hb REF3基因的c DNA序列为基础,分别构建了筛选Hb REF3相互作... 详细信息

橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)等橡胶粒子蛋白可能通过相互作用形成蛋白复合体在橡胶生物合成发挥作用。为鉴定REF家族中一新成员Hb REF3的互作蛋白,以橡胶树Hb REF3基因的c DNA序列为基础,分别构建了筛选Hb REF3相互作用蛋白的3种诱饵载体p GBKT7-Hb REF3-F(含全长ORF序列)及p GBKT7-Hb REF3-N(含N端序列)和p GBKT7-Hb REF3-C(含C端序列),并分别转化到Y2H Gold酵母菌株中,进行诱饵表达载体的自激活性与毒性检测。实验证明,3种诱饵载体转化的酵母菌能在SD/-Trp平板上正常生长,而在SD/-Trp/-His/-Ade平板上不能生长,因此,诱饵载体本身没有自激活性,它们的表达产物也没有毒性,不影响转化酵母菌Y2H的生长,满足作为诱饵质粒的条件,并用于橡胶树胶乳c DNA酵母表达文库的筛选。结果表明,用Hb REF3基因的全长ORF编码产物作诱饵,没有筛选到任何候选互作蛋白,而用Hb REF3的N端和C端区域分别作诱饵,均筛选到了可能与Hb REF3具有相互作用的候选蛋白,其中包括REF家族的其他成员和膜联蛋白D4等。

关键词：橡胶树橡胶延伸因子酵母双杂交诱饵载体互作蛋白