氮素响应基因OsAATx对氮素利用的调控

作     者：黄丽君 

作者单位：湖南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孟栓

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：水稻 氮素利用 氨基酸转运蛋白 基因表达 氮素响应 

摘      要：氮是水稻必须的大量营养元素,是决定水稻产量和品质的关键因素之一。自20世纪60年代以来,农业氮肥投入量不断增加,导致氮利用效率（Nitrogen use efficiency,NUE）不高,甚至导致水体富营养化等农业环境污染问题。如何提高水稻NUE是亟待解决的问题,解析水稻氮素利用机制是提高NUE的基础。氨基酸态氮是水稻体内利用的主要氮素形态之一,其运输和分配由氨基酸转运蛋白直接控制。本论文从响应外界氮素水平的氨基酸转运蛋白基因OsAATx入手,利用生物信息学手段和q RT-PCR技术分析了其基本的结构和表达特征,通过CRISPR-Cas9技术和农杆菌介导的遗传转化分别获得了其突变体材料和过量表达株系,结合不同氮素处理的表型观测和生理分析,研究了OsAATx在调控氮素利用中的功能和初步的作用机制。主要结果如下:（1）生理数据测定结果表明水稻体内氨基酸含量和分配受外界氮素水平调控,进一步根据芯片数据中水稻氨基酸转运蛋白基因表达的情况,获得响应外界氮素水平的基因OsAATx,其在根部的表达受氮素缺乏抑制。水稻OsAATx有两种转录剪切形式OsAATx.1和OsAATx.2。进一步的q RT-PCR结果表明,OsAATx.1在根部的表达量远高于OsAATx.2,而在地上部的表达量则低于OsAATx.2;不同氮浓度处理的表达量分析结果表明,两者在根部和地上部的表达量与氮素水平紧密相关,在低浓度氮素条件下被抑制;不同氮素形态处理的基因表达分析表明,氮不足对OsAATx.1和OsAATx.2的抑制主要是由于外界铵（NH4）缺乏引起。OsAATx.1和OsAATx.2启动子区域含有响应激素ABA（脱落酸）和JA（茉莉酸）的顺式作用元件,为了进一步探究氮缺乏对OsAATx.1和OsAATx.2抑制是否由这两种激素信号介导,本研究检测了不同激素处理下OsAATx.1和OsAATx.2的表达水平,结果表明OsAATx.1、OsAATx.2在根部和地上部的表达都受JA诱导,JA是否参与氮素对OsAATx.1和OsAATx.2表达水平的调控有待后续明确。（2）为研究OsAATx基因的功能,我们利用CRISPR-Cas9技术构建了OsAATx在中花11（ZH11）和日本晴（Nip）背景中的敲除突变体材料（osaatx-1、osaatx-2,osaatx-3;以上材料均同时敲除了OsAATx.1和OsAATx.2）,并筛选获得了纯合不含转基因载体的移码突变株系。以株高和根长作为指标的表型分析结果表明,Nip背景突变体osaatx-1、osaatx-2在低氮条件下表现出比野生型株高显著降低,根长显著变长的表型;ZH11背景突变体osaatx-3在不同氮水平下均表现出株高降低,根长增长的表型。本研究也构建了OsAATx.1和OsAATx.2在Nip中的过量表达材料,获得了纯合的过量表达株系。初步的表型分析结果表明,在不同氮水平下,OsAATx.2过量表达植株均表现出株高显著增高的表型。（3）为进一步解析OsAATx基因的作用机制,该研究对不同处理下的水稻材料进行了15NH4标记处理和15N含量测定。结果表明,osaatx-1 osaatx-2和osaatx-3突变体地上部15N含量显著低于野生型,且osaatx-3突变体根中15N含量也显著低于野生型,暗示OsAATx可以促进水稻对外界氮素的吸收和向地上部的转运;利用OsAATx.1和OsAATx.2的过量表达材料进一步证实了OsAATx的作用,过量表达材料中,根和地上部的15N含量均显著高于野生型;后续游离氨基酸含量的测定结果表明,osaatx-1 osaatx-2和osaatx-3突变导致根部总游离氨基酸含量显著高于野生型,说明OsAATx对于水稻根系氨基酸向地上部转运有贡献,继而促进植物从外界吸收氮素。利用氨基酸转运缺陷的酵母突变体开展的异源互补实验结果表明,OsAATx.1和OsAATx.2均不能互补该突变体的缺陷表型,暗示该基因可能受到水稻体内其他因子的调控或参与细胞内的氨基酸分配,间接影响了氮素的吸收和向地上部的运输。