人参皂苷的酶转化及其抗炎活性研究
作者单位：长春中医药大学
学位级别：硕士
导师姓名：于珊珊
授予年度：2024年
学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要：目的:本研究应用分子生物学技术,在大肠杆菌中克隆、表达了来源于Streptomyces *** G7菌的β-糖苷酶Srglu1,并对Srglu1进行纯化及酶学性质表征。同时,将Srglu1应用于人参皂苷的酶转化中,利用高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS),对Srglu1转化人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc的过程进行定性和定量研究,鉴定其转化产物的化学结构,同时建立该酶转化以上四种人参皂苷的最适反应条件及最佳工艺参数,阐明转化路径及转化机制。此外,我们建立斑马鱼尾鳍截肢炎症模型,探究人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc及其转化产物对斑马鱼中性粒细胞向损伤部位迁移活动的影响,为人参皂苷进一步的药理活性研究以及开发高疗效,低毒副作用的抗炎新药物和临床应用提供科学依据。 方法: 1.应用分子生物学技术,克隆、表达了来源于菌的β-糖苷酶Srglu1。 2.采用镍柱亲和层析方法对重组β-糖苷酶Srglu1进行分离纯化,利用SDS-PAGE凝胶电泳分析,确定重组β-糖苷酶Srglu1的纯度及分子量。Streptomyces *** G7 3.使用紫外分光光度法对Srglu1的酶活力及酶学性质(包括最适温度及温度稳定性、最适p H及p H稳定性,底物选择性、有机溶剂和金属离子对酶活力的影响等参数)进行研究。 4.使用薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)对Srglu1转化人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc的产物进行结构鉴定,同时分析其转化路径及转化机制。 5.建立斑马鱼尾鳍截肢的急性炎症模型,通过荧光显微镜观察人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、F2、C-O+C-Y、C-Mc-1+C-Mc、C-Mx-1+C-Mx对中性粒细胞向损伤组织的迁移活动,初步探索以上人参皂苷的抗炎活性。 结果: 1.我们对来源于Streptomyces *** G7菌的重组β-糖苷酶Srglu1进行了克隆,表达及纯化,经序列同源性比对分析及系统发育学分析,β-糖苷酶Srglu1属于糖苷水解酶家族一(GH1),纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE检测,蛋白分子量为48k Da,该分子量与预测分子量一致。 2.对重组β-糖苷酶Srglu1进行酶学性质表征,确定了Srglu1是一种同时具有β-D-吡喃葡萄糖苷和β-D-吡喃乳糖苷活性的双功能酶,其最适温度为56℃,最适p H为7.4;同时发现Srgu1在宽范围内具有较好的热稳定性和p H稳定性。 3.通过TLC、HPLC及HPLC-MS对转化后的人参皂苷结构鉴定,确定重组β-糖苷酶Srglu1水解人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc的转化路径如下:Rb1→Gyp XVII→F2,Rb2→C-O→C-Y,Rb3→C-Mx-1→C-Mx,Rc→C-Mc-1→C-Mc,以上四种皂苷底物在3 h内均被转化完全。Srglu1对人参皂苷的转化机制分析表明:该酶能够定向水解人参皂苷Rb1,Rb2,Rb3、Rc的C-3位葡萄糖,C-20位外侧葡萄糖,生成稀有皂苷Gyp XVII、F2、C-O、C-Y、C-Mx-1、C-Mx、C-Mc-1和C-Mc。 4.建立斑马鱼尾鳍截肢炎症模型,探讨人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc及其转化产物的抗炎活性,结果显示:人参皂苷Rb1及其产物F2、人参皂苷Rb2及其产物(C-O+C-Y)、人参皂苷Rb3及其产物(C-Mx-1+C-Mx)、人参皂苷Rc及其产物(C-Mc-1+C-Mc)均可抑制中性粒细胞向损伤部位的迁移,呈现较好的抗炎效果。 结论:来源于Streptomyces *** G7菌的β-糖苷酶Srglu1属于GH1家族,该酶可以在大肠杆菌中大量可溶性表达,并且可应用简单方便的镍柱亲和层析纯化,Srglu1反应条件范围广泛,为酶的工业化应用提供选择。我们采用了HPLC及HPLC-MS的分析方法对人参皂苷转化产物及其路径进行确定,发现Srglu1能够定向水解人参皂苷Rb1,Rb2,Rb3、Rc的C-3位葡萄糖,C-20位外侧葡萄糖,生成稀有皂苷Gyp XVII、F2、C-O、C-Y、C-Mx-1、C-Mx、C-Mc-1和C-Mc。鉴于Srglu1在转化稀有人参皂苷的过程中具有催化效率快,专一性高,无副产物的优势,在稀有人参皂苷工业应用方面具有很大的应用潜力。此外,我们建立斑马鱼炎症模型,对酶转化人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc及其产物进行抗炎活性的初步探讨,可为开发相关天然抗炎药物提供理论支撑。
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