花生壳多酚提取物调控胰岛β细胞自身胰岛素抵抗的机制研究

作     者：熊莹珠 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：于亚莉

授予年度：2024年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 1002[医学-临床医学] 08[工学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 083201[工学-食品科学] 10[医学] 

主      题：花生壳多酚 大孔树脂 α-葡萄糖苷酶 MIN6胰岛β细胞 胰岛素抵抗 

摘      要：随着科技、生产水平的发展,不规律、不健康的饮食习惯和运动习惯使糖尿病患者增多,饮食治疗贯穿糖尿病治疗的全过程,可以缓解和改善糖尿病的相关症状。胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病的特征之一,大多数研究都通过改善胰岛素抵抗来缓解糖尿病。花生壳多酚是花生壳中主要的活性成分,前人研究表明花生壳多酚提取物具有抗氧化、抑菌、降血糖等活性。关于花生壳多酚改善胰岛素抵抗的研究较少,胰岛细胞自身胰岛抵抗的作用及机制尚未见报道。因此,开展花生壳多酚提取物调控胰岛β细胞自身胰岛素抵抗的机制研究,对于进一步明确花生壳多酚提取物的降糖机制,拓展其应用具有重要的现实意义。 本文以花生壳为原料,采用热浸法提取获得花生壳多酚粗提物;选用8种大孔吸附树脂,通过静态吸附和解析实验,筛选适合分离纯化花生壳多酚的大孔吸附树脂并确定纯化工艺;通过体外ABTS+和DPPH自由基清除能力,考察其抗氧化活性;通过酶活性抑制实验、酶抑制动力学和荧光淬灭实验探究花生壳多酚对α-葡萄糖苷酶活性的影响;建立高糖高脂胰岛β细胞自身胰岛素抵抗模型,在细胞水平探究胰岛素信号通路中相关蛋白分子的表达,综合分析花生壳多酚提取物改善胰岛素抵抗细胞模型分子调控机制。具体研究内容与结果如下: （1）大孔树脂分离纯化花生壳多酚及其组分分析。通过吸附-解吸动力学实验,筛选出HPD-600型为最优树脂,吸附时间为3 h,解吸时间为2 h;花生壳多酚粗提物纯化最佳工艺为花生壳多酚粗提物溶液浓度0.4 mg GAE/m L,p H 1.0,上样流速2 m L/min,乙醇体积分数90%,洗脱流速为2 m L/min,乙醇体积160m L;在上述条件下,花生壳多酚的纯度由9.84%提高到58.31%,效果显著;采用LC-QTOF-MS/MS鉴定花生壳多酚的有效组分,通过数据库比对,圣草酚和木犀草素为花生壳中最主要的两种多酚类物质,此外还含有秦皮乙素、乙酰白藜芦醇、秦皮甲素、槲皮素等80种酚类物质。 （2）花生壳多酚纯化物的体外降血糖活性评价。以纯化后的花生壳多酚为研究对象,对其抗氧化活性及酶抑制活性进行考察,结果表明,花生壳多酚纯化物具有一定的抗氧化活性,且ABTS+自由基清除能力优于DPPH自由基清除能力,IC50值分别为0.071 mg/m L和1.125 mg/m L;酶动力学分析表明,花生壳多酚纯化物具有一定的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用,且存在剂量效应关系,随着花生壳多酚纯化物浓度的增加,其对酶活性的抑制率也逐渐增大,其IC50为0.019mg/m L;同时花生壳多酚纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型属于可逆混合型抑制;荧光实验结果表明,花生壳多酚纯化物与α-葡萄糖苷酶通过相互作用形成配合物,使α-葡萄糖苷酶中的荧光基团发生静态淬灭,同时使α-葡萄糖苷酶的构型发生改变,荧光光谱发生了红移。 （3）花生壳多酚纯化物对胰岛β细胞自身胰岛素抵抗相关信号转导通路的影响。结果表明,0.01-0.1 mg/m L花生壳多酚提取物对胰岛β细胞的活性和胰岛素分泌影响小,且0.06-0.1 mg/m L具有显著作用,因此,选择0.06 mg/m L和0.1mg/m L作为改善胰岛素抵抗的低浓度和高浓度;其次,构建高糖高脂胰岛素抵抗模型:0.200 m M棕榈酸+22.5 m M葡萄糖诱导MIN6细胞,并考察低浓度（0.06mg/m L）和高浓度（0.1 mg/m L）花生壳多酚提取物对高糖高脂胰岛素抵抗模型细胞活性和胰岛素分泌的影响;结果显示,低浓度（0.06 mg/m L）和高浓度（0.1 mg/m L）花生壳多酚均能改善高糖高脂胰岛素抵抗模型胰岛β细胞活性和胰岛素分泌;蛋白免疫印迹实验证实,高糖高脂处理MIN6细胞,激活了胰岛素抵抗相关信号通路中PI3K、AKT和AMPK蛋白分子的表达,抑制了JNK和IRE1蛋白分子的表达;加入浓度为0.06 mg/m L和0.1 mg/m L的花生壳多酚处理后,均可显著上调PI3K、AKT和AMPK,下调JNK和IRE1蛋白分子的表达。