M2型小胶质细胞外泌体介导Fas/FasL信号通路调节神经元程序性坏死对帕金森病小鼠的神经保护作用研究

作     者：宋家志 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘佳梅

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：帕金森病 小胶质细胞 外泌体 程序性坏死 Fas/FasL信号通路 

摘      要：目的: 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是全球发病率第二高的神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases,ND)。探索PD的发病机制,并找到科学有效的根治方法和手段,仍是当前实验室和临床研究的重点,具有重要的现实意义。外泌体(exosome)是一种可以在细胞间传递遗传物质和蛋白质的细胞外囊泡,其作为细胞间载体具有调节受体细胞活性的作用,并可以在神经退行性疾病中引起错误折叠的蛋白质如α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-syn)的迁移。已证实M2型小胶质细胞外泌体可抑制α-syn沉积,减轻神经元损伤,从而缓解PD相关症状,所以本研究首要目的是探讨M2型小胶质细胞外泌体对PD小鼠脑内的神经保护作用及其发挥作用的可能机制。 Fas受体具有结合配体的细胞外结构域和细胞内死亡结构域(Death domain,DD)。在与其特异性配体FasL结合后形成三聚体,并通过其DD募集含有同源DD的Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain,FADD),FADD再通过其死亡效应结构域(Death effector domain,DED)募集procaspase-8结合形成死亡诱导信号复合体(Death-inducing signaling complex,DISC)。DISC可以通过两种机制诱导细胞死亡即经典的caspases途径激活caspase-8诱导细胞凋亡,和受体相互作用蛋白激酶(Receptor-interacting protein kinase,RIPK)1/RIPK3信号通路诱导细胞程序性坏死。DISC作为凋亡和程序性坏死两种途径的交叉点,在PD中具有重要意义。传统观念认为,当细胞凋亡受到抑制时程序性坏死开始被激活。但已经有研究证实,在PD小鼠模型中,程序性坏死和细胞凋亡是可以同时发生的,且通过敲除RIP3/MLKL基因抑制程序性坏死,从而发挥对PD模型脑损伤的保护机制并不受凋亡的影响。因此,本研究第二个目的是探讨M2型小胶质细胞外泌体对PD小鼠脑内神经细胞程序性坏死的影响,并探索其可能机制。 方法: 通过脑内注射6-羟基多巴胺盐酸盐(6-Hydroxydopamine hydrochloride,6-OHDA)建立PD小鼠模型,通过APO旋尾实验和旷场实验观察M2型小胶质细胞BV-2外泌体对PD小鼠运动行为的影响。通过苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色检测M2型小胶质细胞BV-2外泌体对PD小鼠脑黑质区神经病理性改变的影响。通过酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫荧光染色检测M2型小胶质细胞BV-2外泌体对PD小鼠脑黑质区神经元存活的影响。通过酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测M2型小胶质细胞BV-2外泌体对PD小鼠脑黑质区多巴胺(Dopamine,DA)及其在细胞代谢中产生的高香草酸(Homovanillic acid,HVA)和二羟基苯乙酸(Dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)、5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)及其在细胞代谢中产生的5-羟吲哚乙酸(5-Hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)的影响。通过原位末端凋亡法(Td T-mediated d UTP-biotin nick end labeling,TUNEL)检测M2型小胶质细胞BV-2外泌体对PD小鼠脑黑质区神经元凋亡的影响。通过免疫荧光检测M2型小胶质细胞BV-2外泌体对PD小鼠脑黑质区α-syn沉积的影响。通过免疫印迹试验即Western blot检测M2型小胶质细胞BV-2外泌体对PD小鼠脑黑质区DISC相关蛋白caspase-8、pro-caspase-8、Fas、FasL、FADD及程序性坏死关键蛋白p-RIPK1、RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL和MLKL表达的影响。 结果: 1.M2型小胶质细胞BV-2外泌体降低6-OHDA诱导的PD小鼠旋尾次数和静止时间,增加小鼠移动总距离和移动速度,改善小鼠脑黑质区神经元形态并增加TH阳性细胞数、DA、DOPAC、HVA、5-HT、5-HIAA含量,减少神经元凋亡以及α-syn沉积,从而改善黑质区神经病理性改变。 2.M2型小胶质细胞BV-2外泌体下调6-OHDA诱导的PD小鼠黑质内DISC相关蛋白caspase-8、Fas、FasL、FADD及程序性坏死关键蛋白p-RIPK1、p-RIPK3、和p-MLKL的表达。 结论: 1.M2型小