家蝇SVWC5基因的免疫功能研究

作     者：孙思雨 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐婷;柳峰松

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：家蝇 SVWC 模式识别受体 细胞免疫 体液免疫 

摘      要：Single von Willebrand factor C-domain proteins（SVWCs）是一个主要在节肢动物和软体动物中鉴定的蛋白质家族,其特征是具有单一的von Willebrand因子C型结构域。并参与宿主防御、抗逆和营养代谢等多种生理过程。SVWC基因家族在家蝇（Musca domestica）基因组中大规模扩增,成员总数高达35个。前期的转录组测序显示,多个家蝇SVWC（MdSVWC）基因的表达响应细菌刺激而显著上调,提示MdSVWC可能参与家蝇抗菌免疫,然而其背后的分子机制仍然没有充分了解。本研究以家蝇为实验材料,选择MdSVWC5作为SVWC家族的代表进行研究,重点对其表达特征、重组蛋白的细菌结合活性和免疫调节功能进行了分析,并借助CRISPR/Cas9技术获得了MdSVWC5功能缺失突变体(MdSVWC5-/-),进而对MdSVWC5-/-的抗病能力进行了分析,主要研究成果如下: 1、经同源搜索,从家蝇基因组中共筛选到35条SVWC基因序列。比较基因组学发现SVWC基因家族在双翅目昆虫基因组中显著扩张,尤其是在家蝇和厩蝇中数量最多。家蝇和厩蝇的SVWC家族在成员数量、分子分化和保守结构方面具有显著的相似性。MdSVWC5具有典型的SVWC结构域及其8个保守半胱氨酸残基。 2、qRT-PCR检测发现,MdSVWC5在家蝇脂肪体和肠道中都高度表达;在细菌刺激后,幼虫体内MdSVWC5转录水平显著升高。利用大肠杆菌表达系统对MdSVWC5进行了重组表达。体外实验发现r MdSVWC5能够通过识别多种病原体相关分子模式（PAMPs）而结合于细菌和酵母的表面,并表现出Ca2+依赖的微生物凝集活性。用r MdSVWC5包被细菌会增加血细胞对细菌的吞噬能力,从而增强宿主对细菌的清除。 3、MdSVWC5缺失突变体(MdSVWC5-/-)在细菌刺激后表现出较野生型（WT）更高的死亡率和较低的细菌清除能力。MdSVWC5-/-血细胞对体内细菌的吞噬效率显著低于WT,并伴有更低的吞噬相关基因（Mdlamp、Mdrab5、Mdmyosin）表达水平。值得注意的是,MdSVWC5-/-幼虫的血细胞种类发生了显著变化,与野生型相比,突变体的粒血胞比例降低,浆血胞和珠血胞的比例升高。这些结果提示MdSVWC5参与宿主细胞免疫反应。 4、细菌刺激后,MdSVWC5-/-体内抗菌肽（Muscin,Diptericin,Cecropin）基因的表达水平显著降于WT,提示MdSVWC5对体液免疫具有调控作用。 综上研究结果,SVWC可能是一种新型的可溶性模式识别受体家族,能够识别多种PAMPs,介导宿主对病原的免疫识别,并通过调理血细胞的吞噬作用及激活抗菌肽基因的表达来调节宿主防御反应,在调控细胞免疫和体液免疫应答方面发挥重要作用。