基于ATP水解和CRISPR/Cas12a联用检测食品中碱性磷酸酶活性方法的建立与评价

作     者：赵锦彬 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐坤

授予年度：2024年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：碱性磷酸酶 三磷酸腺苷 CRISPR/Cas12a 食品检测 食品安全 

摘      要：目的: 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）活性是禽畜疾病诊断、营养调节以及评价牛奶巴氏杀菌合格的关键指标,在食品检测和食品科学研究中具有重要意义。传统的ALP活性检测方法主要基于ALP的催化底物水解的反应,但水解底物较少,这在一定程度上限制了基于ALP水解反应的新方法的开发;还有一些基于开发新的有机荧光探针,但探针制备复杂,且存在毒性会造成潜在的隐患。因此,若能充分利用现成ALP底物同时结合当今快速发展的新型检测工具,开发一种简便、灵敏、快速、环保、可靠的食品中ALP活性的检测方法对于确保食品安全是非常有必要的。 方法: （1）“Apt-Activator分子识别锁探针的制备及优化:利用NUPACK软件模拟“Apt1-Apt2-Activator-Cr RNA碱基序列结合情况;选择Apt1、Apt2、Activator链不同结合长度、比例、缓冲Buffer和Apt长度进行探针优化。 （2）检测体系的建立及对中转底物ATP反应的条件优化:不同浓度Activator链激活体系切割验证;体系响应ATP的检测性能及特异性验证;对中转底物-ATP的孵育条件如ATP底物浓度、“ATA分子识别锁探针浓度、反应体系p H、孵育时间进行了实验条件优化。 （3）检测体系的评价:验证分子识别锁探针结合CRISPR/Cas12a体系检测靶标ALP的检测性能和特异性;所构建方法用于鸡、牛、羊、马、猪五种禽畜血清和市售脱脂牛奶等实际样品中ALP活性含量进行检测,并与标准ALP检测试剂盒、市售牛奶ALP检测试纸条等方法进行比较,判断所构建方法的准确性和可靠性。 结果: 1.制备了分子识别锁探针并优化了探针碱基长度、结合比例、结合缓冲Buffer和CRISPR/Cas12a成分。优化结果显示,“ATA分子识别锁探针中Apt1-Activator-Apt2结合比例为1.5:1:1.5为最佳比例;最佳缓冲Buffer定为Buffer B;CRISPR/Cas12a体系中Cr RNA最佳浓度为125 n M,Cas12a最佳浓度为100 n M。 2.所构建方法的最佳反应条件为:中转底物-ATP浓度是31.25μM,“ATA分子识别锁探针浓度是50 n M,整个实验最佳的p H是9.0,ALP与ATP水解最佳孵育时间为40 min。 3.所构建方法无需复杂的制备、孵育步骤,对中转底物-ATP检测显示在ATP浓度范围为0–250μM内,检测方法呈现出良好的线性关系,其线性方程式为y=207.5x+600.1（R2=0.98）,具有良好识别ATP分子的特异性;方法对ALP检测效果显示在ALP浓度范围为0-18.75 m U/m L,该检测方法呈现比较良好的线性关系,其线性方程式为y=-138.3x+3374.2（R2=0.97）,检测限（LOD）为2.52 m U/m L;该方法对ALP实现特异性响应,而不受牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶等物质干扰,具有良好的特异性。 4.所构建方法的检测的时间为70 min,并且在检测鸡、牛、羊、马、猪五种畜禽血清和市售脱脂牛奶中ALP活性含量时,取得与ALP检测试剂盒、牛奶ALP检测试纸条相一致的结果。 结论: 1.本研究建立了一种基于ALP对ATP催化水解反应、分子识别锁探针和CRISPR/Cas12a技术联用快速、灵敏、实用的ALP荧光定量检测方法。 2.本方法不需要进行复杂探针制备过程,也不需要特别复杂精密的仪器,提高了检测速度以及可适用性,整个反应需要70 min。 3.所建立的方法对ALP活性的检测显示检出限为2.52 m U/m L,线性范围在0-18.75 m U/m L,具有良好的检测性能和出色的特异性。 4.所建立的方法进行鸡、猪、羊、牛等畜禽和牛奶加标模拟样品的检测,加标回收率在92%—99%,效果较好。