五味子丙素生物合成关键P450酶基因鉴定及功能表征

作     者：付瀚钰 

作者单位：中南林业科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王森

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：华中五味子 五味子丙素 亚甲二氧基 异源表达 生物合成途径 细胞色素P450 

摘      要：五味子丙素(schisandrin C)属于联苯环辛二烯(dibenzocyclooctadiene,DBCOD)型木脂素,是华中五味子(Schisandra sphenanthera)中最重要的活性成分之一,因其结构独特且药效显著而被广泛关注,苯环上对称的亚甲二氧基被认为是其发挥药理作用的重要活性基团。然而,五味子丙素的生物合成路径仍在很大程度上未知,两个特征性亚甲二氧基的形成是其生物合成未解决的标志之一。植物天然产物中亚甲二氧基结构的形成依赖于细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)。基于此,课题组推断并重点解析了五味子丙素中两个亚甲二氧基形成的生物合成路径:以前戈米辛(pregomisin)为前体,形成DBCOD型木脂素的骨架结构戈米辛J(gomisinJ),先在戈米辛J上形成一个亚甲二氧基生成戈米辛L2(gomisinL2),再在戈米辛L2上生成另一个对称的亚甲二氧基,最终形成五味子丙素。推测两步反应均由CYP450催化,其功能表征是五味子丙素生物合成途径解析的一大难点。 本研究以华中五味子为植物材料,通过探究五味子丙素在不同组织中的含量差异,结合转录组分析,筛选出参与华中五味子中五味子丙素亚甲二氧基形成的候选CYP450s,利用底物喂养酵母异源表达的方法成功鉴定出首个五味子丙素生物合成途径中亚甲二氧基结构形成相关CYP450酶,并通过同源建模、分子对接等技术初步预测了CYP719A43催化活性的关键氨基酸残基。主要研究结果如下: (1)戈米辛J、五味子丙素和五味子酯甲在华中五味子不同组织中的含量均存在显著差异,三者在果实和根中的含量均显著高于其他组织,戈米辛L2在各组织中均未检测出。 (2)利用Illumina高通量测序技术,对华中五味子雌雄株不同组织进行转录组测序、组装和功能注释,最终获得74213条unigenes,其中共有43886条(59.14%)unigenes在五大数据库中得到注释。进一步筛选得到华中五味子中252条CYP450s,通过系统发育分析将其划分为7个clan的36个家族。通过生物信息学分析,最终筛选得到参与五味子丙素中亚甲二氧基形成的4条候选CYP719As和1条候选CYP81Qs。 (3)本研究克隆了5条候选CYP450s,并成功构建了其酵母异源表达载体,通过底物喂养的方法成功验证出一条可以分别催化五味子丙素生物合成中两个亚甲二氧基形成的候选基因(SsCYP152)。按照CYP450国际命名委员会命名规则,暂将其命名为SsCYP719A43。 (4)经过同源建模与分子对接分析,SsCYP719A43酶蛋白与底物戈米辛J和戈米辛L2的结合模式表明,R130和R431与底物成环的两个含氧基团形成了氢键作用。因此,推断R130和R431是促进SsCYP719A43蛋白酶催化形成亚甲二氧基的关键氨基酸残基。