miR-199a-5p通过靶向PTPN9促进缺氧心肌成纤维细胞表型转化的机制研究

作     者：高先佈 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴弘

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：microRNA PTPN9 心肌纤维化 心肌成纤维细胞 缺氧 

摘      要：研究背景 急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病患者死亡的主要原因,全球每年约有730万人死于AMI,随着心血管疾病防治措施的规范及血管介入技术的不断进步,AMI的死亡率明显下降,近年已从原来的20%-30%逐渐下降至5%左右。但AMI后不论是否接受再灌注治疗,心肌组织均会发生重构,表现为心脏扩大,射血分数下降,导致心力衰竭,严重影响患者的预后及生活质量。研究表明,心肌梗死后过度的修复性纤维化及非梗死区域的反应性纤维化均会影响心脏的收缩或舒张功能,进而加重心力衰竭的进展,心肌梗死后缺血缺氧心肌组织释放多种炎症因子,促进心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞并持续的增殖与分泌胶原蛋白,心肌成纤维细胞的表型转化是心肌梗死后心脏发生恶化性重塑的重要原因。 在过去的几十年中,微小核糖核酸(microRNA,miRNA)的靶向治疗已成为一个新兴的研究领域。miR-122是一种在肝脏中高度表达的miRNA,丙型肝炎病毒的生命周期与miR-122密切相关,目前研究发现使用miR-122抑制剂可抑制丙型肝炎病毒的活性。此外发现miRNA在肿瘤生长调控中发挥重要作用,miR-34a作为一种抑制肿瘤生长的miRNA在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多种实体肿瘤中表达下降,可通过调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭来抑制肿瘤细胞的生长,miR-34a模拟物已被研究作为一种潜在治疗策略来抑制肿瘤细胞的生长。miRNA作为关键靶点在心肌梗死、心力衰竭、动脉粥样硬化等多种心血管疾病中同样发挥重要作用,miR-208是一种在心肌组织中高度表达的miRNA,研究表明,抑制miR-208可减少心肌梗死后心肌纤维化,改善心脏功能,miR-126则在内皮细胞中高度表达,研究发现,miR-126的模拟物可以促进内皮细胞的增殖和血管生成,减缓动脉粥样硬化的进展。因此,探讨miRNA在心肌梗死后心肌成纤维细胞表型转化中的功能和机制具有重要价值。 miR-199a-5p作为心肌组织中表达较多的miRNA,既往研究证实可促进AMI后心肌细胞的病理性肥大,然而,miR-199a-5p是否影响AMI后心肌成纤维细胞表型转化尚不清楚,无相关研究报道。为探讨miR-199a-5p在心肌梗死后心肌成纤维细胞中的作用,本课题组运用蛋白质谱分析与生物信息学分析发现miR-199a-5p靶基因为酪氨酸蛋白磷酸酶非受体9型(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 9,PTPN9),既往研究表明PTPN9在抑制肿瘤生长、囊泡融合与运输、胰岛素信号转导调节中起到重要作用,而PTPN9在调节心肌梗死后纤维化方面没有相关研究,本课题拟探讨其在心肌梗死后心肌成纤维细胞表型转化中的作用机制。 本研究拟通过构建大鼠AMI及缺氧心肌成纤维细胞模型来研究miR-199a-5p对心肌成纤维细胞表型转化的作用机制,以期为AMI后心力衰竭预防提供新的治疗方向和潜在治疗靶点。 第一部分:急性心肌梗死后心肌组织及缺氧心肌成纤维细胞中miR-199a-5p 的表达 研究目的 明确AMI后组织中及缺氧心肌成纤维细胞中miR-199a-5p的表达变化。 研究方法 1、构建大鼠心肌梗死模型:以SD大鼠为实验动物,应用冠状动脉左前降支结扎法构建AMI模型,分为AMI组(n=17)、假手术(Sham)组(n=13),术后将大鼠放在同样温度、湿度、养料充足条件下饲养,1周处死大鼠,取出心脏,纵向切开心脏,组织苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin,HE)制作病理切片,显微镜拍照后通过图像软件进行分析评估心肌缺血区域变化;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)检测梗死心肌组织中miR-199a-5p的表达水平。 2、构建缺氧心肌成纤维细胞表型转化模型:体外大鼠原代心肌成纤维细胞分离培养,并通过缺氧(37℃,5%O2,5%CO2)刺激模拟AMI后心肌成纤维细胞表型转化;检测心肌纤维化标志物表达变化:胶原蛋白Ⅰ型α1链(collagen Type Ⅰ Alpha 1 chain,COL1A1)、胶原蛋白Ⅲ型α1链(collagen Type Ⅲ Alpha 1 chain,COL3 A1)和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA);划痕实验与CCK-8实验观察心肌成纤维细胞迁移能力与增殖水平的变化;qPCR检测miR-199a-5p在缺氧心肌成纤维细胞中的表达变化。 研究结果 1、大鼠AMI后心肌组织miR-199a-5p表达升高:大鼠前降支结扎1周后,HE染色显示:AMI组大