雄激素介导鸡IGF2BP1基因转录的调控机制研究

作     者：胡晓玉 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李文婷

授予年度：2024年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：鸡 IGF2BP1 雄激素 转录调控 等位基因特异性表达 

摘      要：胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白1基因(The insulin-like growth factor-2 m RNAbinding proteins-1,IGF2BP1)是影响鸡生长性状的主效基因,课题组前期鉴定出IGF2BP1调控区域的三个等位基因,分别为W(野生型)、L1(chr27:6082202-6085435缺失3.2 kb)和L2(chr27:6083984-6085538缺失1.5 kb),且该等位基因L1和L2对生长和体尺性状有正向促进作用。利用固始-安卡F2资源群734个个体的表型-基因型数据分析,发现IGF2BP1杂合基因型(L1W)个体对应的生长性状的遗传模式存在性别差异。基于此,本研究旨在探究鸡IGF2BP1基因在不同性别中的转录调控机制。首先通过等位基因特异性表达试验明确L1W个体的性别差异非印记基因引起,而是由于不同性别中存在不同的遗传模式产生的差异。利用双荧光素酶报告试验鉴定到鸡IGF2BP1核心启动子区,并预测得出2个潜在的雄激素受体(Androgen receptor,AR)结合位点;后续以雄激素作为效应因子模拟不同性别的体内环境,通过添加雄激素及其拮抗剂处理不同基因型(L1L1/WW)的细胞系,明确了雄激素可以调控鸡IGF2BP1基因表达。采用过表达、AR结合位点定点突变、DNA pull down及转录组测序等技术进行联合分析,深入解析雄激素介导的鸡IGF2BP1基因的转录调控机制。具体研究结果如下: 1.鸡IGF2BP1不同性别L1W表达规律及等位基因表达分析 通过等位基因特异性PCR对豫农M系肉鸡群体进行分型鉴定,挑选L1L1、WW、L1W基因型公母个体用于实时荧光定量PCR,结果显示,在公鸡中L1W杂合子个体的IGF2BP1基因的表达量与L1L1个体的基因表达无差异,且显著高于WW野生纯合个体,但在母鸡中呈现相反的表达规律;对IGF2BP1进行等位基因特异性表达分析,发现等位基因L1/W在各组织中均为双等位基因表达,且等位基因L1优于W,具有更高的表达水平,说明IGF2BP1为偏等位基因表达模式。明确了鸡IGF2BP1不同性别L1W基因型表达非印记基因引起,而是不同性别中存在差异遗传调控模式。 2.鸡IGF2BP1核心启动子区鉴定 根据鸡IGF2BP1原因突变,对其启动子区进行保守性估计及甲基化预测,构建不同保守区段的启动子区截短体;利用双荧光素酶报告试验鉴定到其核心启动子区位于-1700～+1;通过在线预测网站分析,发现鸡IGF2BP1核心启动子区域存在JUND、RNUX1、TFAP2A、SP1、MYCN、MEF2A、KLF4等生长发育相关转录因子结合位点,且该核心区域可能还存在2个AR结合位点,表明L1W个体生长性状存在性别差异受到雄激素的调控。 3.雄激素介导AR/STAT3调控鸡IGF2BP1基因转录调控 通过添加雄激素处理两种基因型的细胞,发现雄激素对IGF2BP1两种等位基因W L1的调控存在差异,其中W等位基因受到抑制,而L1等位基因则得到促进;这种调控作用可以被雄激素拮抗剂比卡鲁胺消除,即雄激素通过雄激素受体(AR)介导调控IGF2BP1表达。过表达AR载体及核心启动子区点突变载体至细胞后进行双荧光素酶报告试验,结果显示,过表达AR后WW基因型细胞IGF2BP1的启动子活性有所降低,且雄激素受体结合位点(ARE)的突变显著增强了启动子活性,表明AR结合ARE直接调控IGF2BP1的转录。为深入探究雄激素对IGF2BP1等位基因的转录调控机制,利用DNA pull down技术鉴定到3个特异性结合IGF2BP1的转录因子,结合转录组数据,分析发现转录因子STAT3受雄激素调控并能够抑制IGF2BP1的启动子活性。综上,雄激素可直接通过AR介导或与STAT3结合间接调控IGF2BP1等位基因的表达。 综上所述,鸡IGF2BP1基因在不同性别杂合子中的表达受雄激素调控,其中雄激素抑制W等位基因而增强L1等位基因的表达。通过鉴定IGF2BP1等位基因W的核心启动子区域,并结合转录因子筛选,揭示了AR和STAT3在该基因表达调控中的潜在作用,为理解性激素如何影响IGF2BP1表达提供了新的见解,也为鸡生长性状的遗传机制解析提供理论依据。