Nlrp3在睡眠剥夺促进牙周炎进展及牙周炎大鼠认知损伤的研究

作     者：马浩楠 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：于维先

授予年度：2024年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：牙周炎 睡眠剥夺 认知功能障碍 焦亡 NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 

摘      要：研究背景: 牙周炎(periodontitis)是一种由牙菌斑生物膜引发的慢性炎症性疾病。牙周病原菌与宿主反应之间的相互作用是牙周炎进展的关键,在易感宿主中,细菌感染会引起炎症和免疫反应之间的失衡,从而导致牙周膜、牙槽骨和牙骨质持续的炎症反应和组织破坏。此外,牙周微生物可以通过血源性易位、炎性细胞因子和其他细胞介质从牙周组织溢出进入血液循环,进而影响心脑血管疾病、认知障碍、糖尿病等全身性疾病的发生和发展。 睡眠是一个重要且具有规律性的生理活动,每晚遵循规律的睡眠程序,能够确保人体在白天发挥出最佳状态。在睡眠期间,身体的各项生理功能会经历多种变化,包括血压、心率、激素分泌、免疫防御功能的调节、细胞修复、温度控制和记忆能力的恢复等。然而由于多种因素,睡眠不足和睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)已成为普遍存在的问题。严重的睡眠剥夺可能导致昼夜节律的紊乱失调、神经受损、免疫功能下降、抵抗力减弱、记忆力受损和血脑屏障破坏等一系列问题。此外已有研究证实,睡眠剥夺会对牙周炎和认知功能产生不良影响。 NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,Nlrp3)是一种典型的炎症小体,其形成和激活受到信号分子的变化或外部刺激的影响。激活后的Nlrp3会诱导半胱天冬酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)的激活从而导致孔道形成蛋(Gasdermin D,GSDMD)的裂解,进而促进促炎细胞因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-18(Interleukin-18,IL-18)的释放,最终导致细胞焦亡。细胞焦亡是一种特定类型的调节性细胞死亡,类似于细胞凋亡。近年来,细胞焦亡成为一个热门的研究领域,越来越多的研究表明它与多种疾病密切相关。例如,有大量研究证实焦亡与睡眠剥夺和牙周炎之间有着密切关联,然而它们三者之间的机制尚未完全阐明。因此本研究通过建立睡眠剥夺及牙周炎模型,来探讨睡眠剥夺是否会扰乱昼夜节律并加重牙周炎大鼠的认知损伤;以及初步研究和探讨睡眠剥夺是否可能通过激活Nlrp3炎性小体来加重牙周炎。 方法: 随机选取32只雄性Wistar大鼠,将它们分为四组:对照组(control,C)、牙周炎组(Periodontitis,P)、睡眠剥夺组(sleep deprivation,SD-C)和睡眠剥夺+牙周炎组(SD-P)(每组8只)。对照组不进行任何处理,采用正畸结扎丝对牙周炎组和睡眠剥夺+牙周炎组大鼠的双侧上颌第一磨牙进行结扎;对睡眠剥夺组(SD-C组和SD-P组)采取改良多平台法建立睡眠剥夺模型。经过八周后,对各组大鼠进行各项行为学实验并检测大鼠的各项指标。随后,对所有大鼠进行安乐死,于冰上收集血清、牙周组织、下丘脑和海马组织。各项检测指标如下: 1.行为学检测 通过水迷宫实验,旷场实验和新物体识别实验评价各组大鼠的学习、记忆和抗焦虑能力,探究睡眠剥夺对牙周炎大鼠认知功能的影响。 2.脑组织相关指标检测 (1)苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE)和尼氏染色(Nissl staining)评价海马组织结构破坏程度及神经元损伤程度。 (2)免疫组织化学染色以及实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测下丘脑组织中昼夜节律基因Bmal1和Clock的表达情况。 3.血清学检测 Elisa试剂盒检测血清中皮质醇(cortisol,CORT)和促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)水平,以及炎症因子IL-18和IL-1β水平。 4.牙周组织相关指标检测 (1)检测并拍摄记录各组大鼠口内基本情况,包括牙龈组织的颜色,形状和质地; (2)检测大鼠牙周组织的各项临床指标,包括牙齿松动度,牙周探诊深度和牙龈出血指数; (3)Micro-CT对上颌第一磨牙进行三维重建并分析记录相关数据; (4)HE和TRAP染色评价牙槽骨吸收程度和牙周组织的病理学改变; (5)HE染色评价牙周组织的炎症程度; (6)Mito SOX red染色评价牙周组织的氧化应激水平; (7)Tunel染色检测牙周组织的细胞凋亡水平。 5.焦亡相关指标检测 RT-q PCR和免疫组织化学染色检测牙周组中Nlrp3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β和IL-6的基因及蛋白的表达水平。 结果: 通过采用改良多平台法建立睡眠剥夺模型,成功导致大鼠处于昼夜节律紊乱的应激状态。正如Elisa检测血清中CORT和ACTH的水平以及下丘脑中昼夜