Ⅲ型干扰素和枸杞糖肽在抗SARS-CoV-2感染的作用和机制研究

作     者：范君言 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹广文

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：SARS-CoV-2 Ⅲ型干扰素 枸杞糖肽 抗病毒药物 新冠受体 

摘      要：研究背景和目的 新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019,COVID-19）是由新型冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的严重威胁人类健康的传染病,目前全球累计新冠确诊病例超6亿人,给世界带来了严重的公共卫生危机和沉重的社会经济负担。尽管疫苗接种和单克隆抗体疗法降低了与SARS-CoV-2感染相关的发病率和死亡率,但刺突基因的一系列突变体影响其疗效,再次引发大规模人员流行和损失的风险持续存在。因此,有必要进一步研究针对变异病毒的抗病毒药物干预措施,尤其是在疫苗和特效药研制成功之前,为应对新发突发传染病做好前期药物储备。 新的抗病毒药物研发生产必须投入大量的资金和时间,而采取“药物新定位的策略,拓展已批准药物的适应症范围,可以降低药物的安全风险,减少研发投入成本,并缩短开发周期。鉴于目前抗病毒药物种类有限且其作用有限,提升人体自身免疫力被认为是对抗病毒最有效的方式。作为一种广谱抗病毒药物,干扰素被视为抑制多种呼吸道病毒复制和传播的重要天然因子。通过早期干预提高机体固有免疫,干扰素可能发挥关键作用,评估其在抗击COVID-19中的潜在作用是应对当前病毒大流行的一种有效的策略。在新冠疫情初期缺乏疫苗和特效药的情况下,中药的可获得性具有关键的重要性。最早的《新型冠状病毒感染诊疗方案》中也强调了中西医结合的防治方针。近年来,病毒性呼吸道传染病频繁暴发,中医药中的天然多糖及其衍生物已被证明具有抗多种病毒的生物活性,如SARS-CoV-1、甲型H1N1流感病毒等。研究表明,枸杞糖肽（Lycium barbarum Glycopeptide,LbGp）可以增强人体免疫力,从而有助于抵抗病毒感染。可见,挖掘传统中药中的有效成分,阐明其抗病毒和免疫调节作用机制,进一步发挥中药在SARS-CoV-2感染治疗中的作用,为应对突发新发传染病增强内生动力。 本课题从Ⅲ型干扰素和枸杞糖肽两个方面进行探索,以SARS-CoV-2作为切入点,观察在病毒感染早期进行药物预防性干预对疾病的影响,评价两种药物在体内外抗病毒活性,阐明其在抗病毒和免疫调节作用机制,提出针对性的免疫策略,在后疫苗时代针对新冠病毒免疫逃逸变异和其他新发病毒性传染病的早期预防,进而预防和化解重大公共卫生危机具有极其重要的意义。 一、Ⅲ型干扰素在抗SARS-CoV-2感染的作用和机制研究 干扰素（Interferon,IFN）是人体产生的一类具有多功能活性的细胞因子,是先天免疫系统清除病毒感染的重要武器,鉴于其广泛的抗病毒效果以及良好的安全性,常被选为抗病毒药物联合治疗的一部分。干扰素分为3大型:I型干扰素（IFN-α和IFN-β）、II型干扰素（IFN-γ）和Ⅲ型干扰素（IFN-λ）,其中IFN-γ主要在免疫调节方面发挥作用,抵抗病毒感染的主要是I型干扰素和Ⅲ型干扰素。所有有核细胞均可以产生I型干扰素并且表达I型干扰素受体,在抵抗病毒感染时往往伴有炎症因子表达带来的病理损伤。而Ⅲ型干扰素主要产生于黏膜屏障,而且选择性的作用于黏膜上皮细胞和少部分免疫细胞,发挥抗病毒作用的同时控制了免疫病理损伤,是呼吸道抗病毒免疫中的良好效应分子。本课题拟使用细胞和叙利亚仓鼠感染模型评估Ⅲ型干扰素在体内外的抗病毒活性,阐明Ⅲ型干扰素抗SARS-CoV-2感染中的作用机制,明确其发挥抗病毒的重要生物学过程和关键靶标分子。 （一）研究方法 1.细胞层面上,使用Ⅲ型干扰素预处理NCI-H1650、Calu-3肺腺癌细胞系后,分别利用新冠假病毒和真病毒进行感染,检测荧光酶活性和细胞内病毒载量,评价Ⅲ型干扰素在体外的抗病毒活性。 2.依托SARS-CoV-2仓鼠感染模型,在感染SARS-CoV-2前使用Ⅲ型干扰素预先滴鼻给药,检测肺组织匀浆中病毒载量和评估肺组织病理损伤情况,评价Ⅲ型干扰素在体内的抗病毒活性。 3.结合文献调研,qRT-PCR初步验证Ⅲ型干扰素对多种新冠感染受体的表达影响;研究不同的给药策略,利用qRT-PCR、WB探索不同浓度梯度、不同时间梯度的干扰素刺激对ACE2和TMPRSS2的表达影响。 4.以基因转录调控机制为主要切入点,研究Ⅲ型干扰素对重要新冠感染受体表达调控的具体机制。通过文献调研和生物信息学分析,筛选出调控ACE2和TMPRSS2基因的启动子和增强子并构建质粒,瞬时转染细胞后,利用双荧光报告基因实验探索Ⅲ型干扰素对受体转录水平的影响。结合前期实验结果,通过qRT-PCR、WB实验探索Ⅲ型干扰素对转录因子NR4A2表达水平的影响,对其敲低以展开回复实验。 5.在细胞水平,利用新冠假病毒感染NCI-H1650、Calu-3肺腺癌细胞系,评估Ⅲ型干扰