联合磁珠与裂解酶LysGH15检测金黄色葡萄球菌方法的建立与评价

作     者：康汉莉 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：顾敬敏

授予年度：2024年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：金黄色葡萄球菌 裂解酶 LysGH15 磁珠 检测方法 

摘      要：联合磁珠与裂解酶Lys GH15检测金黄色葡萄球菌方法的建立与评 价 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称***)简称金葡菌,是一种常见的人畜共患病原菌。它能够在空气、水、灰尘、物体表面以及动物和人类之间广泛传播,具有强大的生存和适应能力,对细菌性疾病的防控构成了持续的挑战。因此,迫切需要建立一种能够快速、灵敏、有效检测金黄色葡萄球菌的方法。相较于抗体和适配体,噬菌体裂解酶体积小、易获取、成本低,在致病菌检测领域的应用日益广泛。本研究采用双位点识别方式,以金黄色葡萄球菌为检测对象,建立了一种联合磁珠与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶Lys GH15,并利用绿色荧光指示来检测金黄色葡萄球菌的新方法。 Lys GH15对金黄色葡萄球菌表现出特异性的裂解活性。本研究将裂解酶Lys GH15发挥细胞壁水解活性的关键氨基酸第54位半胱氨酸突变成丙氨酸得到Lys GH15-C54A,通过融合PCR技术将Lys GH15-C54A与增强绿色荧光蛋白EGFP进行串联表达成功构建重组质粒p GEX-4T-1-Lys GH15-C54A-EGFP,并使用带有GST-tag的p GEX-4T-1载体来增强目的蛋白的可溶性表达,通过优化诱导温度、IPTG浓度等条件获得纯化后的目的蛋白,利用激光共聚焦显微镜进一步验证了其特异性结合金黄色葡萄球菌并产生绿色荧光的能力。 利用裂解酶Lys GH15的突变体Lys GH15-C54A制备了Lys GH15-C54A-MBs裂解酶偶联磁珠,特异性捕获金黄色葡萄球菌,形成二元复合物。构建了Lys GH15-C54A-EGFP重组蛋白,该蛋白可结合二元复合物中的金黄色葡萄球菌表面空位,利用这种双位点识别方式实现金黄色葡萄球菌的荧光检测。荧光强度变化作为检测金黄色葡萄球菌的指标:在没有检测到金黄色葡萄球菌时,重组荧光蛋白Lys GH15-C54A-EGFP自由存在于溶液中,荧光强度不低于磷酸盐缓冲液对照组;当检测到金黄色葡萄球菌时,荧光蛋白标记于细菌上,导致溶液中游离蛋白减少,荧光强度降低。对溶液中荧光强度的变化与细菌各浓度梯度之间的关系进行线性回归分析,建立一种金黄色葡萄球菌快速检测方法。本研究还探索了磁珠捕获细菌体系中磁珠加入量、Lys GH15-C54A包被量、捕获时间对检测性能的影响。结果显示,磁珠加入量60μL、Lys GH15-C54A包被量30μg、捕获时间25 min为该方法的最佳检测条件。在最优条件下,对不同浓度的金黄色葡萄球菌进行检测。表明该检测体系具有良好的特异性,在金黄色葡萄球菌浓度为9.9×10～2～1.0×10～6 CFU/m L范围内具有良好的线性关系,线性相关系数为0.99,该方法可在1 h内实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。 使用本研究建立的检测方法对100份生牛乳临床样本进行检测。结果显示,28份样品检出为阳性,72份为阴性,阳性检出率为28%(28/100)。用常规PCR方法检测到35份样品为阳性,65份为阴性,阳性检出率为35%(35/100)。使用Baird-Parker平板培养法检测到31份样品为阳性,69份为阴性,阳性检出率为31%(31/100),这与我国生牛乳中金葡菌的检出率主要在15%～38%的数据相符。通过Baird-Parker平板培养法复核检测,本研究建立的方法与Baird-Parker平板培养法的阳性符合率为90.3%、阴性符合率为95.8%,且本研究建立的方法未出现假阳性结果。 综上所述,本研究成功建立了一种联合磁珠和裂解酶Lys GH15并利用荧光信号检测金黄色葡萄球菌的新方法,该方法操作简单,裂解酶易获取,且能在1h内完成对金黄色葡萄球菌的检测,在用于金黄色葡萄球菌检测方面显示出应用潜力,为金黄色葡萄球菌的快速检测提供了新的思路。