玉米乙烯响应因子ZmEREB148功能与机制解析

作     者：潘梦影 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董永彬

授予年度：2024年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：玉米 籽粒发育 AP2/ERF家族 ZmEREB148 调控机制 

摘      要：玉米(Zea mays L.)是我国重要的粮食、经济和饲料作物,在保障我国粮食安全方面具有重大意义。籽粒是玉米产量的直接构成因素,研究玉米籽粒发育过程中基因的调控机制,可以为玉米遗传改良提供理论依据。AP2/ERF家族是一类植物特异性转录因子,在植物的生长发育、激素调控以及胁迫应答中发挥着重要作用。课题组前期从玉米中同源克隆了一个AP2/ERF家族基因ZmEREB148,洋葱表皮细胞亚细胞定位表明该基因编码蛋白定位于细胞核,酵母实验表明该基因编码蛋白具有转录激活活性,转录水平和蛋白质水平表达分析结果显示该基因在玉米胚乳发育的早期和晚期表达量较高,并获得以玉米自交系B104为遗传背景ZmEREB148的CRISPR/Cas9编辑突变体和过表达转基因材料。在此基础上,开展了玉米原生质体亚细胞定位,对编辑突变体和过表达转基因材料进行分子鉴定和籽粒表型分析,测量籽粒淀粉和蛋白质含量,筛选互作蛋白分子,开展DAP-seq和RNA-seq组学分析,以及验证ZmEREB148与下游靶基因的调控关系。本研究解析了ZmEREB148在玉米籽粒发育中的功能和调控机制,为玉米籽粒性状遗传改良奠定了良好基础。 主要研究结果如下: 1.对玉米自交系B104不同发育时期籽粒中ZmEREB148表达特征进行分析,显示该基因在授粉后12天表达量最高;玉米原生质体亚细胞定位表明ZmEREB148编码蛋白位于细胞核中;ZmEREB148过表达株系与对照相比,百粒重增加11.84%、粒长增加3.67%、粒宽增加4.26%,粒长呈差异显著,粒宽和百粒重呈差异极显著。ZmEREB148的3个编辑突变体比对照的百粒重分别降低27.70%、13.46和26.70%,粒长分别降低10.17%、5.38%和7.04%,粒宽分别降低11.89%、8.53%和11.87%,均达到差异极显著。这表明ZmEREB148正向调控玉米籽粒发育。 2.对zmereb148纯合突变体和对照不同发育时期籽粒的灌浆速率进行分析,显示突变体各个时期的籽粒鲜重和干重均低于对照,在授粉后20天时差异最大,表明zmereb148突变降低了籽粒的灌浆速率。对成熟籽粒扫描电镜观察,显示zm EREB148过表达株系籽粒中的淀粉颗粒体积变大,数量变少,且分布较为疏松,形状规整;而突变体籽粒中淀粉粒变小,数量增多,且分布更加紧凑,形状不规则。突变体籽粒总淀粉和支链淀粉含量比对照降低,直链淀粉和蛋白质含量升高,而过表达株系籽粒表现则相反。 3.利用DAP-seq技术分析ZmEREB148结合基序,共检测到3262个峰点,其中位于启动子、外显子、转录终止区、基因间区和内含子区的比例分别为64.19%、28.72%、2.97%、2.11%和1.99%,并通过EMSA实验验证了5个基序。ZmEREB148结合基序位于启动子区有2083个,这些基因主要参与蛋白质活性,包括转移酶活性、激酶活性和蛋白质磷酸化。 4.对zmereb148编辑突变体和对照授粉后12天籽粒进行转录组分析,共获得2716个差异表达基因,其中上调基因1543个,下调基因1173个。KEGG分析显示碳代谢、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、内质网蛋白质加工等20条通路显著富集。 5.对DAP-Seq和转录组数据进行联合分析,共获得326个被ZmEREB148调控的差异表达基因,其中包括MYB、GRAS、b HLH、NAC、Aux/IAA、WRKY和AP2/EREBP等转录因子 6.利用双荧光素报告系统分析表明ZmEREB148对启动子的活性有控作用;选择ZmRGH3、ZmSS4和ZmEIL8三个基因的启动子进行双荧光素酶报告基因活性分析,显示ZmEREB148可以显著提高ZmRGH3、ZmSS4和ZmEIL8的启动子转录水平。