白纹伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的击倒抗性与代谢抗性机制研究（双翅目：蚊科）

作     者：袁浩 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马雅军

授予年度：2024年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：白纹伊蚊 菊酯类杀虫剂 击倒抗性 代谢抗性 RNA-seq CYP450 RNAi 

摘      要：白纹伊蚊(Aedes albopictus)广泛分布于全球温带、亚热带和热带地区,可传播登革热、寨卡病毒病、黄热病、基孔肯雅热等多种疾病,媒介控制是防控蚊媒病的重要环节。因此,应用化学杀虫剂控制蚊媒病的传播已成为普遍情况,而长期大量使用杀虫剂已导致白纹伊蚊对杀虫剂敏感性下降,使蚊虫的防控产生失败风险,已成为重要的公共卫生问题。多项研究表明白纹伊蚊产生杀虫剂抗性是多种机制共同作用的结果,其中最重要的是击倒抗性和代谢抗性。本研究检测和分析了白纹伊蚊现场群体在菊酯类杀虫剂选择压力下击倒抗性基因的进化趋势;使用转录组测序,在现场高抗性群体中筛选与代谢抗性相关的代谢解毒酶基因表达变化情况;利用RNAi技术,验证筛选的细胞色素P450基因介导的代谢抗性机制在白纹伊蚊对溴氰菊酯杀虫剂抗药性产生中的作用。本研究从击倒抗性和代谢抗性两个方面,探讨了白纹伊蚊对菊酯类杀虫剂抗性的产生机制,为解决白纹伊蚊的杀虫剂抗药性治理问题提供了新的思路。取得以下主要结果: 1.现场采集了上海市16个群体的白纹伊蚊,检测了658只白纹伊蚊的VGSC基因部分片段的突变情况,发现在V1016、I1532和F1534位点存在非同义突变,突变类型有V1016G、I1532T、F1534S、F1534C和F1534I。首次在白纹伊蚊中发现了新的VGSC基因突变类型F1534I,在上海群体中首次报告了V1016G和F1534C。统计发现总的突变频率为80.55%,除奉贤区群体全部为野生型外,其他15个群体均存在不同程度的突变。 2.对上海白纹伊蚊群体VGSC基因不同的突变类型及其频率进行统计,V1016位点突变等位基因为GGA/G(7.14%),I1532位点突变等位基因为ACC/T(3.42%),F1534位点的3种突变等位基因分别为TCC/S(62.77%)、TGC/C(1.06%)和ATC/I(0.15%)。未发现3个位点同时突变的个体情况,两个位点同时突变的个体有86个(13.07%),V1016和F1534位点同时突变的个体最多,共60个(9.12%)。通过与以往资料的比较分析上海白纹伊蚊群体VGSC基因突变进化趋势,显示各群体的VGSC基因突变类型增多,且突变频率升高。 3.获得VGSC基因Domain Ⅲ内的内含子5种类型,分别为内含子A(83 bp)、B(68 bp)、C(80 bp)、D(72 bp)和E(70 bp)。在本研究638个个体中,内含子B最多,占87.30%,其次是A,占12.07%,其他类型较少,统计发现具有内含子B的个体,明显有F1534位点突变倾向。 4.应用上海枫泾(FJ)、朱家角(ZJJ)和嘉定(JY)的对溴氰菊酯抗性高的白纹伊蚊群体,转录组测序获得接触0.4%溴氰菊酯药膜组和空白药膜组的差异表达基因,3个群体的差异表达基因分别为7354个(FJ群体)、6728(ZJJ群体)、1416(JY群体),共同上调的基因69个、下调的53个。q RT-PCR验证部分基因的结果显示与转录组测序的表达趋势相同。 5.对差异表达基因进行GO显著富集分析,结果显示FJ群体主要富集在催化活性、氧化还原酶活性等酶活性相关代谢过程,ZJJ群体主要富集在结合、细胞过程等代谢相关过程,而JY群体富集数量明显较多的是细胞膜、质膜、膜固有成分、膜整体成分等膜相关的GO term,3个群体的差异表达基因GO富集结果存在差异。 6.筛选与代谢抗性相关的细胞色素酶P450、谷胱甘肽-S-转移酶、羧酸/胆碱酯酶、UDP-葡萄糖醛酸基转移酶和ABC转运蛋白基因的差异表达情况,显示FJ群体上调的基因99个,下调31个,ZJJ群体上调57个,下调11个,JY群体上调12个,下调9个。3个群体中仅有注释为CYP4C1的LOC109418974基因同时下调,无同时上调的基因。若分析2个群体的情况,发现在FJ和ZJJ群体中,同时上调的有28个基因,其中CYP450s有CYP12A2、CYP28A5、CYP4D2、CYP6A14、CYP6A2、CYP9F2、CYP9B2。 7.以筛选获得的转录本LOC109398898(基因注释为CYP28A5)作为目的基因,设计了相应的si RNA,对白纹伊蚊FJ群体雌性成蚊进行显微注射。对注射后的白纹伊蚊进行q RT-PCR检测,结果显示目的基因的表达大幅下降,接触溴氰菊酯进行生物测定后,与对照组(42.91%)相比,死亡率明显上升(82.44%)。结果提示干扰CYP28A5基因的表达,可能会影响白纹伊蚊对溴氰菊酯的抗性产生。 本研究对上海市各区白纹伊蚊群体VGSC基因进行了全面测定,首次在上海市发现了V1016G和F1534C突变,发现了新的突变类型F1534I,表明上海市白纹伊蚊群体对菊酯类杀虫剂的击倒抗性发展处于快速进化的阶段