ZIF-8/Cu药物递送系统用于胃癌免疫治疗的效果及机制研究

作     者：宋沛哲 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王大广

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胃癌 纳米药物递送系统 肿瘤治疗 免疫治疗 cGAS-STING通路 

摘      要：背景及目的: 2020年全球新发胃癌超过100万例并最终导致约77万人死亡,在所有恶性肿瘤中胃癌的发病率位居第五、死亡率位居第四。胃癌的高死亡率主要归因于超过70%的患者在首诊时已处于晚期或进展期。目前针对晚期转移性胃癌的治疗策略是以抗肿瘤药物为主的综合治疗,包括化疗、靶向治疗以及免疫治疗等。而晚期胃癌的临床免疫治疗主要是以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗。其中ICIs与化疗的联合策略在大量临床试验中可观察到全人群的生存获益,并在PD-L1表达阳性人群中获益更为显著,因此ICIs与化疗的联合已成为晚期胃癌患者的一线治疗。然而由于胃癌的高侵袭性和高异质性,ICIs的治疗策略仍然存在获益比例低或复发率高等问题,这需要对肿瘤免疫微环境更精准全面的评估和筛选,包括肿瘤突变负荷、PD-L1表达以及微卫星不稳定性等生物标志物。 目前大量临床前实验已经证明纳米药物递送系统可调节肿瘤免疫微环境中的固有免疫以及适应性免疫以实现肿瘤治疗。基于本课题组前期设计的一种纳米药物递送系统——ZIF-8/Cu@CDDP/DSF@HA,此项研究希望证明该系统不仅能够抑制原发胃癌的进展,同时还能激活肿瘤免疫微环境并促进全身的抗肿瘤免疫反应,从而实现对晚期转移性胃癌的治疗进而改善预后。 方法: 1.复现本课题组已构建的ZIF-8/Cu@CDDP/DSF@HA纳米系统并对其进行表征以证明该纳米体系的成功合成: 先通过配位效应制备纳米级别的药物载体——铜掺杂的ZIF-8。通过机械搅拌法将顺铂和双硫仑装载到纳米载体中。最后利用静电吸附效应将带有负电的透明质酸包裹在纳米载体表面。通过X射线衍射、透射电子显微镜以及电感耦合等离子体质量光谱对纳米系统进行表征。 2.在体内和体外评估ZIF-8/Cu@CDDP/DSF@HA纳米系统的治疗效果和抗肿瘤免疫诱导作用: 通过MTT法体外评估纳米系统对胃癌细胞的增殖抑制作用。通过免疫荧光染色和酶联免疫吸附实验体外评估纳米系统对胃癌细胞免疫原性死亡的诱导作用。在荷双瘤小鼠模型中,通过对原发肿瘤的监测评估体内治疗效果,通过对远端肿瘤的监测评估抗肿瘤免疫的诱导效果。 3.探索抗肿瘤免疫的诱导机制: 通过生物信息学的方法对肿瘤组织的转录本进行分析以寻找潜在的抗肿瘤免疫诱导机制。 4.验证抗肿瘤免疫的诱导机制: 在体内通过对诱导机制的相关蛋白进行定量分析,并测定免疫细胞的丰度变化,以验证抗肿瘤免疫的诱导机制。在体外通过将纳米系统、胃癌细胞和骨髓来源树突状细胞共培养,并定量分析诱导机制相关的蛋白和m RNA,以证明抗肿瘤免疫的诱导机制。 结果: 1.X射线衍射的结果证明了载体ZIF-8/Cu的成功合成。质量光谱的结果证明了顺铂和双硫仑的成功负载以及铜元素的掺杂。透射电子显微镜的结果证明了透明质酸的成功包绕,并揭示了ZIF-8/Cu@CDDP/DSF@HA纳米系统约120nm的尺寸。 2.从MTT法绘制的剂量效应曲线和原发肿瘤的体积变化曲线中获悉ZIF-8/Cu@CDDP/DSF@HA系统无论是在体内还是体外都具有良好的胃癌抑制效果。而钙网蛋白的外翻以及高迁移率族蛋白的释放说明纳米系统在体外具有免疫原性死亡的诱导能力。远端肿瘤的体积变化趋势说明了纳米系统具有良好的诱导抗肿瘤免疫反应的能力。 3.通过对治疗组和空白对照组的肿瘤组织中差异表达基因的筛选以及GO、KEGG、GSEA分析,发现了潜在的抗肿瘤免疫诱导机制——cGAS-STING信号通路。相关蛋白cGAS和INF-β的免疫荧光结果说明纳米系统在体内的干预的确可以激活肿瘤中的cGAS-STING通路。而原发肿瘤和远端肿瘤中CD8+T淋巴细胞的浸润和M1型巨噬细胞的极化能够说明抗肿瘤免疫的成功诱导。此外,体外培养的骨髓来源树突状细胞的蛋白表达(Phospho-IRF3、Phospho-TBK1、cGAS、IFN-β)和m RNA转录水平(Ifnb1、Isg56)的上调证明了纳米系统在体外也可以激活cGAS-STING通路并促进抗肿瘤免疫。 结论: ***-8/Cu@CDDP/DSF@HA纳米系统在体内和体外都展现出良好的肿瘤抑制能力。 ***-8/Cu@CDDP/DSF@HA纳米系统通过对肿瘤的杀伤,激活了cGASSTING信号通路并促进全身的抗肿瘤免疫反应,最终实现了对转移性肿瘤的生长抑制。