阿魏酸对牛卵母细胞体外老化的缓解作用研究

作     者：尹艺静 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张永宏

授予年度：2024年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：阿魏酸 牛卵母细胞 体外老化 氧化应激 凋亡 

摘      要：卵母细胞是家畜繁殖能力的基石。高质量的成熟卵母细胞是受精后早期胚胎正常发育的先决条件,是保证家畜繁殖效率的决定因素。在体外受精(In vitro fertilization,IVF)、胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)、体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)等胚胎工程技术应用过程中,若成熟的卵母细胞未在最佳时间内进行受精或者显微操作,则自然发生老化,卵母细胞质量降低,进而影响受精与核移植后早期胚胎发育能力。因此,缓解卵母细胞老化对提高IVF、ICSI、SCNT等家畜胚胎工程技术效率具有重要意义。 阿魏酸(Ferulic acid,FA)是一种广泛存在于植物细胞壁中的生物活性物质,具有抗炎、抗氧化、抗癌和降血糖等多种生物学作用。课题组前期研究发现,FA可以促进牛卵母细胞体外成熟,提高早期胚胎发育潜能,然而其对牛体外老化卵母细胞的具体作用和机制尚不明确。因此,本研究以牛卵母细胞为实验材料,在卵母细胞体外老化的基础上,通过外源添加FA,利用荧光染色、q RT-PCR、Western blot、RNA-seq等技术方法,探究其对牛卵母细胞体外老化的缓解作用及关键生物学通路,为牛卵母细胞体外成熟体系的进一步优化提供新线索。 具体研究内容与结果如下: 试验一:阿魏酸对牛卵母细胞体外老化的缓解作用 以牛卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes,COCs)体外成熟培养20 h为对照,在此基础上继续培养6、12、24和36 h,观察并记录卵母细胞形态变化,发现卵母细胞异常率呈时间依赖性增加。将COCs随机分为5组,在体外成熟培养液中分别添加0、2.5、5、10和20μM FA,体外老化12 h后,依据卵母细胞异常率筛选出FA最佳处理浓度为5μM。结合SA-β-Gal活性检测,确定COCs体外成熟培养20 h作为对照,体外老化12 h作为老化组,置于5μM FA成熟培养液中体外老化12 h作为FA处理组。通过观察三组卵母细胞形态变化,并结合荧光染色、Western blot和IVF等试验方法,分析FA对牛卵母细胞体外老化的缓解作用。结果表明,相比于老化组,FA处理能够缓解牛体外老化卵母细胞透明带硬化及卵周隙增大;清除细胞内过量ROS并维持GSH水平,增强CAT、SOD活性;提高线粒体活性、膜电位及细胞内ATP水平;降低γ-H2AX阳性比率;提升老化卵母细胞受精能力及早期胚胎发育潜能。Western blot结果显示,FA处理显著降低凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及BAX/Bcl2水平。 试验二:阿魏酸对体外老化牛卵母细胞差异表达基因分析及关键通路发掘 基于FA对体外老化卵母细胞的缓解作用,为明确其具体调控机制,利用RNA-seq技术,探究FA的潜在生物学调控作用并对关键通路进行发掘。通过构建FA处理后体外老化牛卵母细胞差异基因表达谱,筛选出差异表达基因230个,其中128个上调、102个下调。差异表达基因主要富集在细胞间信号传导、细胞质组分、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、Erb B信号通路和PI3K-Akt信号通路等生物学过程和信号通路。Western blot结果显示,FA处理抑制牛体外老化卵母细胞PI3K-Akt通路的激活。 综上所述,FA通过增强体外老化牛卵母细胞的抗氧化能力,改善线粒体功能,缓解DNA损伤,抑制凋亡及PI3K-Akt信号通路激活水平,提高卵母细胞质量及早期胚胎发育潜能。研究结果为延缓卵母细胞体外老化提供新见解,并为卵母细胞质量控制开拓新思路。