河南省部分地区FPV分子流行病学调查及VP2截短蛋白的原核表达

作     者：左守军 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董海聚

授予年度：2024年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猫泛白细胞减少症病毒 流行病学调查 VP2基因 生物信息学分析 原核表达 

摘      要：猫泛白细胞减少症(Feline panleukopenia,FP)是由猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)引起的猫的一种高度传染性疾病,可引起猫厌食、呕吐、腹泻和严重脱水等临床症状。FPV属于细小病毒科、细小病毒属的成员之一,是一种小的、无囊膜的单链DNA病毒。FPV不仅可以感染猫科动物,还可以感染鼬科、浣熊科和熊猫等动物,且FPV呈全球流行,秋冬季高发。VP2蛋白是FPV核衣壳的主要蛋白,决定着FPV的抗原性、趋向性和宿主范围。近年来,我国宠物猫的数量逐年增加,但新的FPV流行数据有所欠缺,尤其是关于河南省FPV流行病学的调查研究、VP2序列和生物信息学结合分析的报道较少,本研究通过调查河南省9个城市的FPV流行情况,选取不同时间、地点的部分FPV阳性样品扩增其VP2序列,进行遗传变异和生物信息学分析,为河南省FPV的防控提供数据参考。为验证河南省FPV突变株的反应原性和免疫原性,本研究通过生物信息学分析,选取突变株FPV China-HN1株的VP2蛋白优势抗原区进行原核表达,以表达的蛋白为抗原免疫动物,对免疫后的血清进行检测,验证其免疫原性和反应原性,为FPV的基因疫苗和免疫学诊断方法提供参考。 1、河南省部分地区FPV分子流行病学调查 共采集猫粪便样品854份,通过PCR共检测出329份FPV阳性样品,总感染率为38.52%(329/854)。对不同影响因素与FPV感染情况进行详细分析发现,在不同地区之间宠物猫FPV的感染率差异较大,其中周口感染率最高,为73.13%(49/67),漯河感染率最低,为5.56%(5/90)。在不同年龄段上,6-12月龄猫的FPV感染率最高,为49.30%(35/71)。未免疫的猫FPV感染率为44.05%(137/311),高于免疫猫的感染率35.36%(192/543);冬季FPV的感染率为43.90%(126/287),远高于秋季的感染率17.46%(22/126)。总体上看地区(P0.01)、年龄(P=0.007)、季节(P=0.012)和免疫情况(P0.01)均显著影响宠物猫FPV的感染率,而是否腹泻和不同性别对宠物猫FPV的感染率没有影响。 结论:本研究通过PCR共检测出329份FPV阳性样品,总阳性率为38.52%(329/854)。对不同影响因素与FPV感染情况进行详细分析,发现地区、年龄、季节和免疫情况均显著影响宠物猫FPV的阳性率。 2、河南省FPV VP2基因序列和生物信息学分析 针对河南省FPV高流行的情况,将第一部分试验中的阳性样品作为研究对象,根据不同采样时间和地点等因素选择部分阳性样品,进行VP2序列的分析,获得河南省流行毒株的突变情况。通过PCR扩增,共获得6个VP2序列,经BLAST比对、氨基酸比对和同源性分析,6个VP2序列均为FPV VP2。对6个FPV VP2进行氨基酸序列分析,共发现5株A91S突变株,6株I101T突变株,且在河南省内多个地区分布,说明河南省的流行毒株主要为A91S和I101T突变株。通过同源性分析,6株FPV毒株与标准株(CU-4)和两株疫苗株(Purevax和Felocell)之间的核苷酸同源性为99.0%-99.5%,氨基酸同源性为99.1%-99.8%。VP2基因分群结果显示,6株流行毒株主要为G3族群,仅有一株为G2族群。综上所述,河南省FPV流行毒株主要为A91S和I101T突变株,且主要为G3族群,这为河南省FPV的防控提供了参考数据。通过生物信息学分析,发现第101位氨基酸的突变改变了VP2蛋白上第97～104位氨基酸残基的抗原指数,使其相对标准株CU-4有所升高。A91S的突变影响了VP2的受体结合能力,但第91和101位氨基酸的突变对VP2蛋白生物活性影响的研究较少。因此,本研究在第三部分对包含有第91和101位氨基酸突变的VP2截短蛋白进行原核表达,并分析第91和101位氨基酸突变对VP2抗原的免疫原性和反应原性的影响。 结论:本研究通过PCR扩增共获得6个FPV VP2序列,对6个FPV VP2序列进行氨基酸序列分析,共发现5株A91S突变株,且在河南省内多个城市分布,说明河南省的流行毒株主要为A91S突变株。通过生物信息学分析,发现第101位氨基酸的突变改变了VP2蛋白上第97～104位氨基酸残基的抗原指数,使其相对标准株CU-4有所升高。 3、FPV VP2蛋白优势抗原区的原核表达及活性鉴定 根据第二部分发现的FPV VP2抗原的氨基酸突变,本部分试验拟分析第91和101位氨基酸突变对VP2抗原的免疫原性和反应原性的影响。因此,通过优势抗原区的原核表达,使用表达的蛋白进行动物免疫试验,验证其免疫原性和反应原性。首先利用DNA STAR