油茶甾醇合成关键基因CoDWF5的鉴定与功能分析
作者单位：中南林业科技大学
学位级别：硕士
导师姓名：袁军
授予年度：2024年
学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学]
摘 要：油茶是我国重要的木本食用油料树种,主要分布于南方丘陵地区。该地区夏季高温干旱频发,严重制约了油茶的生长和结实。前期研究发现高温干旱条件下油茶叶片中的甾醇含量发生显著变化,外源喷施油菜素内酯（BL）能一定程度上提高干旱胁迫下的甾醇含量。为探明油茶在干旱环境下的生理响应以及甾醇代谢调控油茶耐旱性的机理,本研究以油茶‘华硕’为试验材料,研究干旱胁迫及外源喷施油菜素内酯条件下油茶叶片抗氧化酶、渗透调节物质和甾醇含量等指标变异规律;利用转录组数据进行富集分析,明确甾醇生物合成通路中的关键差异表达基因DWF5;通过分子生物学技术,明晰响应干旱胁迫的油茶甾醇合成关键基因CoDWF5的生物学功能,为甾醇代谢调控植物耐旱能力提供参考资料,同时为创制耐旱油茶新种质提供基因元件。主要研究结果如下: 1.外源BL对干旱条件下油茶叶片生理指标的影响。测定对照组（CK）、干旱组（UW）和干旱下喷施油菜素内酯处理组（BL）的光合特性和生理指标,结果表明:与CK对照组相比,干旱处理降低了油茶叶片净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）和水分利用率（WUE）,而干旱下激素喷施BL使得叶片的Pn、Tr和WUE分别提高了 79.8%、56.3%、17.2%;干旱处理下,油茶叶片可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、海藻糖等渗透相关物质和过氧化物酶的含量与CK相比显著增加,BL喷施可以减少物质的累积,缓解了油茶受到干旱胁迫的影响。干旱处理后油茶叶片中脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）含量与CK相比显著升高,而喷施BL后抑制叶片中衰老信号传导,从而减少ABA和JA含量。同时,随着干旱处理时间的增加,UW组与CK组相比四种游离甾醇的含量显著增加,前期叶片中未检测到的菜油甾醇在干旱处理后期出现积累,而喷施BL缓解了油茶的干旱胁迫,进而减少了甾醇的累积。 2.干旱胁迫及外源喷施BL条件下油茶叶片转录组学研究。利用转录组学技术,明确干旱胁迫及外源喷施BL下油茶叶片的基因表达规律。通过转录组共获得 133893 条基因,其中 DAY4-UW vs DAY4-CK、DAY4-BL vs DAY4-UW、DAY6-UW vs DAY6-CK和DAY4-BL vs DAY6-UW比较组中差异基因数量分别为12512、9686、11883和1741个。对DAY4和DAY6时期油茶叶片中各个比较组的表达差异基因进行KEGG富集分析,结果显示UW vs CK比较组均在萜类和多酮类的代谢和脂质代谢类别中显著富集,其中甾醇生物合成通路中的差异基因CoDWF5-1在UW组中表达量显著升高,并在DAY6时期显著增加。由此说明,干旱胁迫会引发油茶叶片中多个代谢路径的变化和基因表达差异,其中甾醇合成关键基因CoDWF5在油菜素内酯调控油茶耐旱性中至关重要。 3.油茶甾醇合成关键基因CoDWF5的生物信息学及表达分析。从六倍体油茶‘华硕’基因组数据中分析鉴定出3个油茶DWF5基因CoD WF5-1/2/3,分别编码206、411、433个氨基酸,均属于拥有跨膜结构的疏水碱性蛋白。通过对油茶不同组织部位中CoDWF5基因的表达模式分析,结果发现3个基因均在根、茎和叶中表达,在根中表达量最高。染色体定位显示CoDWF5-1和CoDWF5-2位于同一条染色体上,位置距离极近;CoDWF5蛋白与同属山茶科的茶树和狭叶油茶DWF5蛋白亲缘关系最近,所有植物DWF5蛋白只拥有1个功能较保守的结构域ERG4ERG24。根据启动子顺式元件分析,CoDWF5-1/2/3基因都有和抗逆反应、光响应、植物激素响应相关元件。 4.油茶CoDWF5基因在干旱胁迫中的功能初探。通过基因克隆技术,获得油茶CoDWF5-1基因全长CDS序列,并进行亚细胞定位。结果显示CoDWF5-1基因全长621 bp,定位于细胞核中。通过花粉管介导法获得CoDWF5-1基因拟南芥的T3代阳性植株,并展开PEG模拟干旱胁迫试验,结果表明3%PEG处理下野生型拟南芥的生长受到抑制,叶柄变短。与野生型相比,转基因拟南芥在含有3%PEG的培养基呈现主根变短、须根数量增加、叶柄变长等现象,叶片萎焉程度明显缓解。实时荧光定量结果显示转基因拟南芥3个株系中GFP基因相对表达量重复性较高,野生型未检测出GFP。由此说明,CoDWF5-1基因在一定程度上提高了转基因拟南芥的耐旱能力。
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