M2巨噬细胞通过上调VEGFR3表达治疗继发性淋巴水肿的作用研究

作     者：马金理 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杜建时

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：继发性淋巴水肿 淋巴管内皮细胞 M2巨噬细胞 VEGFR3 炎症 

摘      要：研究背景 继发性淋巴水肿(Secondary lymphedema)是由多种因素引起淋巴管输送功能障碍,进而造成组织液聚集的渐进性发展疾病。最新研究认为,巨噬细胞在继发性淋巴水肿的发展中发挥重要作用,促进巨噬细胞M2极化能够减轻继发性淋巴水肿的发展,但具体调控机制尚不明确。VEGFR3具有调节淋巴管萌发、促进淋巴管内皮细胞(Lymphatic endothelial cells,LECs)增殖、迁移等重要功能,但巨噬细胞M2极化是否通过促进VEGFR3表达治疗继发性淋巴水肿尚不清楚。 目的 本文拟通过建立继发性淋巴水肿小鼠模型和体外LECs炎症模型,明确M2巨噬细胞对继发性淋巴水肿的治疗效果,阐明在此过程中VEGFR3的功能及调控机制,为药物治疗继发性淋巴水肿提供新的实验依据。 材料与方法 1、8周龄体重约20 g的雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组和模型组,对照组仅做尾部环形切口,模型组通过环切尾部3mm皮肤并切断两侧淋巴管构建继发性淋巴水肿模型,再通过尾部体积测量、近红外Ⅱ区成像及HE染色等方法进行评估;通过检测腹腔巨噬细胞活力及吞噬能力评估小鼠免疫水平变化;通过RT-qPCR法检测鼠尾组织中TNF-α和IL-1β等炎症因子表达量变化;Western Blot法检测鼠尾组织中M1巨噬细胞标志物CD80和M2巨噬细胞标志物CD206蛋白表达量。 2、用2μg/ml的LPS刺激LECs 24 h构建LECs炎症模型。分别利用IFN-γ、LPS和IL-4、IL-13诱导巨噬细胞向M1、M2极化,并收取上清制作条件培养基(分别命名为M1-CM和M2-CM),分别作用于LECs炎症模型,24 h后利用RT-qPCR法检测各组细胞中TNF-α和IL-1β等炎症因子表达量变化。 3、体外培养LECs细胞,经M1-CM、M2-CM处理24 h后,利用细胞迁移实验、EDU细胞增殖实验、淋巴管形成实验检测对LECs细胞功能的影响;利用RT-qPCR法和Western Blot法检测对VEGFR3表达的影响。 结果 1、小鼠尾部皮肤环切及淋巴管切断确切阻断尾部淋巴回流,引起模型组小鼠尾部体积明显增加(P0.05),鼠尾肿胀至少维持4周。 2、模型组鼠尾皮下组织明显增厚,其下可见扩张的淋巴管。 3、与对照组相比,模型组鼠尾组织内TNF-α和IL-1β在m RNA水平表达显著上调(P0.05)。 4、与对照组相比,模型组鼠尾组织内M1巨噬细胞标志物CD80在蛋白水平表达显著升高(P0.05),M2巨噬细胞标志物CD206在蛋白水平表达显著下降(P0.05)。 5、与对照组相比,浓度为2μg/ml的LPS能显著提高LECs细胞TNF-α、IL-1β和IL-18在m RNA水平表达(P0.05)。 6、M2-CM能显著抑制LPS介导的LECs细胞TNF-α、IL-1β和IL-18在m RNA水平表达(P0.05)。 7、与M0-CM和M1-CM相比,M2-CM能促进LECs细胞的迁移、增殖及成管能力(P0.05)。 8、与M0-CM相比,M2-CM能显著上调LECs细胞中VEGFR3在m RNA和蛋白水平的表达(P0.05)。 结论 1、通过小鼠尾部皮肤环切及淋巴管切断成功构建继发性淋巴水肿动物模型,明确继发性淋巴水肿组织中M1巨噬细胞浸润增加及M2巨噬细胞浸润减少能导致鼠尾局部高水平炎症反应; 2、利用LPS诱导的LECs炎症模型,证实了巨噬细胞M2极化能显著抑制LPS介导的LECs细胞炎症反应; 3、阐明了巨噬细胞M2极化可能通过上调LECs中VEGFR3表达,促进LECs细胞迁移、增殖及管形成能力,治疗继发性淋巴水肿。