稀土发光材料制备及时间分辨荧光免疫分析应用研究

作     者：张瑞起 

作者单位：长春工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李雪松;何广义

授予年度：2024年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 10[医学] 

主      题：时间分辨荧光免疫分析技术 稀土螯合物 乙肝表面抗原 新型冠状病毒 

摘      要：随着体外诊断技术的快速发展,侧流免疫层析技术（LFIA）已经成为即时检测（POCT）平台的重要手段之一。时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是依赖于稀土元素独特的荧光性质而发展起来的一种能够实现定量检测分析的免疫检测技术。该技术与LFIA相结合制备了荧光免疫层析试纸条,具有较高的灵敏度、较强的特异性、较好的稳定性以及较宽的检测线性范围,在免疫分析领域展现了良好的应用前景。本文制备了两种稀土双功能螯合物BHHCT和BHHST,并对它们的标记性能进行了研究。同时,本研究还建立了基于稀土荧光探针的时间分辨荧光免疫分析技术用于乙肝表面抗原和新冠病毒N蛋白抗原的定量检测分析,取得了较好的检测效果。主要研究内容和结论如下: 第一部分是制备稀土双功能螯合物BHHCT和BHHST,这两种螯合物具备强荧光和长寿命等特点,以牛血清白蛋白为标记对象,确定最优标记条件。BHHCT和BHHST的最佳反应缓冲液分别是CB（0.1 mol/L p H8.9）和PB（0.1 mol/L p H7.5）,最佳孵育条件是在37℃下孵育1小时,洗脱液选择Tris-HCl（0.05 mol/L p H8.0）。BHHCT与牛血清白蛋白偶联效果更好,标记比更高。因此,后续实验选择BHHCT作为最佳螯合物来制备荧光探针。 第二部分是利用稀土小分子螯合物BHHCT偶联乙肝表面单克隆抗体制备荧光探针,成功制作荧光免疫层析试纸条,建立了一种快速定量检测乙肝表面抗原（HBs Ag）的方法。HBs Ag浓度与T线和C线荧光强度比值T/C之间的线性拟合曲线为y=0.01729x-0.00285,决定系数为0.9996,最低检测限可达0.16 ng/m L。本研究制备的荧光免疫试纸条批内、批间变异系数均低于8%,具有良好的灵敏度和重复性。样品回收率在94.3%～107.8%范围内,在37℃避光保存60天内无明显变化,表明该方法能够满足乙肝病毒的检测要求,并且操作简便,适合即时检测。 第三部分是利用稀土双功能螯合剂BHHCT,一端与Eu螯合,另一端和新冠病毒单克隆抗体分子上的氨基相连接,形成稳定的强荧光探针,基于双抗体夹心法,确定最优工艺参数制备荧光免疫层析试纸条,建立了一种新型冠状病毒抗原荧光免疫层析定量检测方法。该方法在50～20000 pg/m L范围内,N蛋白抗原浓度与T/C值呈良好的线性关系,线性方程为y=0.0072x+0.0333,决定系数为0.9965,最低检测限为27.8pg/m L,具有较宽的线性范围和较高的灵敏度。