重组人Matrilin-3延迟给药抑制缺血性脑卒中诱导的胶质瘢痕形成及其抑制炎症机制

作     者：高德菲 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张慧灵

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：缺血性脑卒中 rhMatrilin-3 星形胶质细胞 胶质瘢痕 炎症 NF-κBp65 

摘      要：目的:Matrilin-3是一种细胞外基质蛋白,本实验室前期研究首次发现Matrilin-3过表达可减小缺血性脑卒中急性期脑梗死体积,并通过抑制炎症反应减少缺血性脑卒中诱导的胶质瘢痕形成。但Matrilin-3是否亦具有独立于其急性期脑保护作用,而抑制胶质瘢痕形成的作用?且其抑制炎症的分子机制是什么?本文采用重组人Matrilin-3(recombinant human Matrilin-3,rhMatrilin-3),观察其延迟给药是否可以抑制脑卒中诱导的胶质瘢痕形成,促进脑功能恢复,并探讨其抑制炎症的分子机制。方法:在体内建立SD大鼠、C57BL/6N野生型小鼠和Matrilin-3基因敲除小鼠短暂性大脑中动脉阻塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型,通过 TTC染色检测Matrilin-3基因敲除对小鼠脑梗死体积的影响。在体内实验中,rhMatrilin-3在缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)后1天通过侧脑室注射(intracerebroventricularly,icv)方式给予,每3天给药一次,通过伊文思蓝(Evans Blue)法检测血脑屏障通透性,脑萎缩体积和神经行为学评分用于评价缺血性脑卒中后脑功能。Western Blotting和免疫组织化学法用于检测体内缺血/再灌注诱导的胶质瘢痕标志蛋白 GFAP(glial fibrillary acidic protein)、neurocan 和 phosphacan 表达。采用免疫组织化学法检测大鼠大脑皮层梗死边缘区炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)蛋白水平以及胶质瘢痕厚度。在体外建立氧糖剥夺/再复氧(oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD/Re)模型进行研究,rhMatrilin-3在再复氧时加入星形胶质细胞培养液中。乳酸脱氢酶(LDH)漏出率用于评估星形胶质细胞损伤情况。采用ELISA法检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平,RT-qPCR用于检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)mRNA水平。利用Matrilin-3质粒对细胞进行瞬时转染以及构建Matrilin-3过表达稳定细胞株,采用Western Blotting、细胞免疫荧光法检测Flag-Matrilin-3 入核现象;通过免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)证明Matrilin-3 与 NF-κBp65(p65)结合现象。结果:第一部分rhMatrilin-3对缺血性脑卒中诱导脑损伤的保护作用***-3基因敲除加重小鼠tMCAO诱导的脑损伤Matrilin-3基因敲除小鼠较野生型小鼠在缺血/再灌注后1天脑梗死体积显著增加。***-3延迟给药改善大鼠tMCAO诱导的脑损伤在大鼠缺血/再灌注后1天延迟给予rhMatrilin-3,第7天通过检测Evans Blue渗出量,结果显示rhMatrilin-3降低缺血性脑卒中大鼠血脑屏障通透性,第28天观察到脑萎缩体积减小,大鼠神经行为学症状明显改善。***-3减少OGD/Re诱导的星形胶质细胞损伤在细胞OGD处理再复氧时加入不同浓度rhMatrilin-3,观察到低浓度rhMatrilin-3可减少OGD/Re诱导的星形胶质细胞LDH漏出率。第二部分rhMatrilin-3抑制缺血性脑卒中诱导的胶质瘢痕的形成***-3在tMCAO诱导的大鼠大脑皮层反应性星形胶质细胞及胶质瘢痕中表达Matrilin-3在tMCAO后2 h、4 h、6 h表达逐渐增加,并随着GFAP阳性细胞增加,其在tMCAO后1 d、3 d、7 d和14 d蛋白水平持续下降到正常水平。***-3抑制tMCAO诱导的大鼠大脑皮层胶质瘢痕形成在大鼠缺血/再灌注后1天延迟给予rhMatrilin-3,第7天检测发现rhMatrilin-3减少大脑皮层胶质瘢痕标志蛋白GFAP、neurocan和phosphacan表达,第14天观察到rhMatrilin-3减少胶质瘢痕厚度。第三部分rhMatrilin-3降低缺血性脑卒中诱导的炎症因子水平***-3抑制tMCAO诱导的炎症反应 在大鼠缺血/再灌注后1天延迟给予rhMatrilin-3,第7天检测发现rhMatrilin-3可以减少缺血/再灌注诱导的大鼠大脑皮层炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达。***-3基因敲除加