徐闻石珊瑚来源共附生真菌中抗炎活性次级代谢产物的研究

作     者：廖清楠 

作者单位：广东海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘亚月;田敏卿

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 10[医学] 

主      题：石珊瑚 共附生真菌 次级代谢产物 抗炎活性 

摘      要：炎症是机体组织受到刺激或损伤后所产生的一种防御性应答反应,与包括神经退行性疾病在内的众多疾病的发生和发展有着密切的联系。珊瑚共附生真菌作为海洋真菌的重要组成部分之一,由于其能够产生结构多样和具有特殊生物活性的次级代谢产物,已被证明是发现新药先导化合物的宝库。 本研究基于单菌株多次级代谢产物策略(One Stain Many Compounds,OSMAC)对徐闻石珊瑚来源的抗炎活性菌株进行了筛选研究。分别利用马铃薯葡萄糖培养基(Potato Dextrose Broth,PDB)和糙米培养基,并设立3种盐度(0.3%、3%、10%)对31株石珊瑚来源共附生真菌进行小规模发酵培养,在以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的BV-2小胶质细胞为炎症模型的指导下,从中筛选得到菌株C1-5、C3-3、C3-8、C3-9和C14-17在糙米培养基的三种盐度下均表现出良好的抗炎活性,对LPS诱导的BV-2细胞中一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的释放显示出显著的抑制活性(P0.05),且呈现显著的剂量依赖性。进一步的TLC分析显示不同菌株次级代谢产物具有明显的差异性,其中菌株C3-9的次级代谢产物种类明显更为丰富,且对DPPH自由基表现出较强的清除活性。 以菌株C3-9作为目标菌株,以糙米作为基础培养基,通过改变盐度(3%和10%)和发酵时间(5、10、15、20和30 d)两个不同的单因素条件,来探究不同发酵条件下菌株次级代谢产物丰富度和抗炎活性的变化。不同发酵培养时间,除个别色谱峰的面积发生了一定的变化,大部分菌株次级代谢产物的种类并没有明显的差异,发酵培养20 d,菌株的次级代谢产物的产量最大。盐度的改变明显影响菌株次级代谢产物的种类变化,随着盐度的增加,菌株次级代谢产物的丰富程度明显下降,与发酵盐度呈现负相关。在进一步的抗炎实验中,C3-9的各发酵粗提物均表现出良好的抗炎活性(P0.05),随着粗提物样品浓度的增加抗炎效果也有所增强;但在10%盐度条件下粗提物的抗炎活性较差,这表明高盐条件可能会抑制菌株中抗炎活性次级代谢产物的产生,使C3-9次级代谢产物的种类和抗炎活性都有所降低。经液相色谱与串联质谱联用(Liquid ChromatographyTandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)与基于特征的分子网络(Feature-Based Molecular Networks,FBMN)结合分析,可发现在C3-9中存在许多抗炎活性物质,且8个特征峰在不同发酵条件下的变化差异很大,在0.3%盐度培养20 d时产物最丰富且产量最大。综上所述,确定菌株C3-9的优选发酵条件为0.3%盐度的糙米培养基,室温下培养20 d。 基于上述筛选获得的最优条件对C3-9进行大规模发酵,减压浓缩,获得粗提物。在抗炎活性的指导下,综合利用正、反相硅胶柱层析柱、Sephadex LH-20凝胶柱、高效液相分析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)等手段对C3-9中的抗炎活性成分进行追踪分离。从中共获得五个化合物,其中一个为已知化合物butyrolactoneⅠ。抗炎活性结果表明:butyrolactoneⅠ具有显著的抗炎活性,且化合物浓度与LPS诱导BV-2细胞释放NO量成正相关。