解毒祛瘀滋阴方对系统性红斑狼疮中NETs的影响及作用机制研究

作     者：任瑞星 

作者单位：浙江中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丁兴红

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：系统性红斑狼疮 解毒祛瘀滋阴方 NETs mtDNA ROS TLR9 

摘      要：目的 探讨解毒祛瘀滋阴方通过抑制系统性红斑狼疮(SLE)中亢奋的氧化应激水平,降低SLE体内ROS含量,从而抑制中性粒细胞NETosis,减少中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成及释放的机制,为临床治疗系统性红斑狼疮提供理论依据。观察解毒祛瘀滋阴方对NETs的调控作用,研究解毒祛瘀滋阴方是否通过影响狼疮小鼠的氧化应激过程,调控Toll样受体9(TLR9)介导的NETosis,从而发挥治疗SLE的作用。方法(1)10名SLE患者、10名健康志愿者纳入本实验。采用密度梯度离心法分离SLE患者、健康志愿者外周血中性粒细胞,各自分别设空白对照组、模型组、醋酸泼尼松组、解毒祛瘀滋阴方组,用佛波酯(PMA)刺激中性粒细胞形成NETs模型,醋酸泼尼松(1mM/L)和解毒祛瘀滋阴方载药血清(12.6g/Kg)给药干预,37℃,5%CO2细胞培养箱中孵育3h并定时观察。免疫荧光染色观察各组中性粒细胞NETs和NETs中mtDNA生成情况并检测活性氧(ROS)水平。(2)选取18只6-8周龄的雌性MRL/lpr小鼠,随机分为模型组、醋酸泼尼松组、解毒祛瘀滋阴方组,并设正常对照组(6-8周龄雌性C57BL/6小鼠),每组6只,动物中心适应性喂养1周后,醋酸泼尼松组和解毒祛瘀滋阴方组分别采用醋酸泼尼松(6.5mg/kg)、解毒祛瘀滋阴方(15.6g/kg)治疗,连续灌胃8周。定期观察小鼠的体表变化和精神状态并记录体重。灌胃治疗8周后处死,计算体重及脏器指数;ELISA法检测各组小鼠血清中抗ds-DNA抗体的表达水平;采用相应的氧化试剂盒检测各组小鼠血清中氧化应激指标丙二醛(MDA)含量、抗氧化指标过氧化氢酶(CAT)含量;Western Blot技术检测MPO、TLR9的表达水平;肾脏冰冻切片免疫荧光染色观察各组小鼠肾脏中NETs生成情况。结果(1)与健康志愿者空白对照组相比,健康志愿者模型组NETs及NETs中mtDNA的含量增多(P0.05),小鼠血清抗ds-DNA抗体水平升高(P0.05),血清氧化应激指表MDA含量明显升高(P0.01),抗氧化应激指标CAT含量明显降低(P0.01),肾脏组织NETs信号增强,NETs中mtDNA数量增多,肾脏中MPO、TLR9蛋白表达水平都较高(P0.01);与模型组相比,解毒祛瘀滋阴方组脾脏、淋巴结肿大改善(P0.05),血清抗ds-DNA水平降低(P0.05),解毒祛瘀滋阴方组小鼠血清中MDA含量则表现为显著性降低(P0.01),CAT含量显著增加(P0.01),肾脏中NETs的生成减少,肾脏中MPO、TLR9蛋白表达水平降低(P0.01)。结论 解毒祛瘀滋阴方能够通过改善氧化应激水平,减少ROS产生,从而抑制NETs的生成,进而调控TLR9介导的NETosis过程,通过改善氧自由基对组织的炎症损伤,从而发挥对SLE的治疗作用。