鹿角多肽的制备、抗衰老活性及其机理研究

作     者：李雲凤 

作者单位：长春工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈晓光

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：马鹿角多肽 酶解法 抗氧化 抗衰老 秀丽隐杆线虫 

摘      要：随着人口老龄化社会的到来,医疗水平的提升,人类在抗衰老的需求越来越迫切。本课题探究马鹿角多肽(Antler polypeptide,AP)对秀丽隐杆线虫的抗衰老活性及其作用机理。采用煎煮法粗提马鹿角蛋白,利用不同蛋白酶分别酶解,通过正交实验优化酶解工艺;通过寿命和氧化应激实验,筛选出抗衰老活性最强的马鹿角多肽为1 mg/m L的中性蛋白酶酶解的马鹿角多肽;通过紫外应激、热应激、运动、吞咽、生殖等实验,检测马鹿角多肽对线虫衰老的影响;通过突变体线虫抗氧化应激能力实验、抗氧化基因表达检测实验,探究其衰老作用机理。研究结果揭示:马鹿角多肽具有显著的抗衰老能力,能够显著地延长线虫的寿命,提升线虫的运动能力,增强线虫对氧化应激、紫外应激和热应激的抵抗力,但对线虫的生殖能力并无明显影响。这种功效的产生或许和马鹿角多肽的氧化还原功能有关,据猜想,这种氧化还原功效主要是由于刺激了线粒体的信号传递途径,从而提高了抗氧化基因的表达量。以下为主要研究结果: (1)鹿角多肽的制备及蛋白酶种类筛选 采用马鹿角粉作为基础材料,秀丽隐杆线虫作为模式动物,利用ABTS清除率作为衡量准则,进行一系列正交试验,不同蛋白酶酶解鹿角多肽的最优工艺。实验结果表明:酶解马鹿角蛋白的最理想蛋白酶是中性蛋白酶。此外,最理想的酶水解方法是:将酶分解的过程持续7小时,添加的酶的浓度是0.1%,料液比是1:15(g:m L),并将温度设定在50℃。 (2)蛋白酶种类的优化、最佳浓度筛选试验 用氧化应激模型验证酶解后,体内抗氧化活性最好的为中性蛋白酶酶解的鹿角多肽(Neutral Antler polypeptide,NAP),且在不同浓度(0.5 mg/m L、1 mg/m L、2.5 mg/m L)中,在1 mg/m L浓度时具有最佳的抗氧化应激能力并能显著延长线虫寿命。 (3)中性蛋白酶酶解的鹿角多肽对线虫衰老指标的影响 利用紫外线刺激、高温刺激、活动、摄食、繁殖等试验,研究马鹿角多肽如何影响线虫的衰老进程。实验结果显示,马鹿角多肽具有显著的抗氧化能力,能够显著地延长线虫的寿命,提升线虫的运动能力,并增强线虫对氧化应激、紫外应激和热应激的抵抗力(在紫外辐射下,线虫的抗性提高了37.12%,在35℃的高温环境下,线虫的抗性提高了38.45%)。然而,这并不会对线虫的生殖能力产生显著影响。 (4)中性蛋白酶酶解的鹿角多肽抗衰老生物活性作用机制研究 通过测量秀丽隐杆线虫体内活性氧自由基(ROS)的含量,研究中性蛋白酶水解的鹿角多肽对野生型线虫体内ROS含量的影响。对传统抗氧化基因的线虫clk-1(qm30)、daf-2(e1368)、eat-2(ad1116)和glp-1(e2144)进行研究,探索中性蛋白酶酶解的鹿角多肽对线虫体内的抗氧化功能的影响路径。通过q-PCR试验,研究中性蛋白酶酶解的鹿角多肽如何改变线虫体内抗氧化基因的表达水平。实验证明,中性蛋白酶酶解的鹿角多肽有助于减少线虫体内的ROS水平,但对突变体线虫clk-1(qm30)的氧化应激抵抗力没有影响。此外,中性蛋白酶酶解的鹿角多肽还能显著提升hsp16.2热抗性基因以及gst-4、gst-7、sod-3抗氧化基因的转录水平。 综上,马鹿角多肽在线虫体内具有的显著的抗衰老活性,可能是通过上调抗氧化基因转录水平,激活线粒体信号通路,从而降低体内活性氧自由基水平,减缓线虫衰老速度的。马鹿角多肽在抗衰老方面具备巨大的药用潜力,本研究为马鹿角深度开发和应用提供了数据依据。