栉孔扇贝FOXL2与SIRT1的互作验证，SIRT1及STARD3的表达模式研究
作者单位：烟台大学
学位级别：硕士
导师姓名：刘晓玲
授予年度：2024年
主 题：FOXL2 SIRT1 STARD3 凝胶滞缓 酵母单杂交 白藜芦醇
摘 要：栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北部沿海的重要经济贝类,其性腺发育相关研究可为性别控制、杂交育种、多倍体育种等提供一定的理论基础。 本实验室前期研究发现:FOXL2(forkhead box protein L2,叉头框蛋白L2)是栉孔扇贝成体卵巢发育的关键基因,并结合FOXL2 RNA干扰前后的转录组差异分析和全基因组染色质免疫共沉淀技术(Ch IP-seq)分析筛选出多个靶基因,结合KEGG分析推测出受FOXL2调控的几条通路,其中包含卵巢功能维持通路和类固醇激素合成通路。 本论文选择上述通路中FOXL2直接调控的SIRT1基因(silent mating type information regulation 2 homolog 1,沉默信息调节因子1)(Ch IP-seq和差异转录组都显示的靶基因)和FOXL2间接调控的STARD3(St AR-related lipid transfer protein 3)基因(仅转录组差异表达分析显示的靶基因)开展研究。转录组差异表达显示,FOXL2上调SIRT1的表达,下调STARD3的表达。对Ch IP-seq分析出的SIRT1基因上的一段与FOXL2结合的片段进行了深入研究,扩增获得该片段对应的基因序列,与SIRT1基因的CDS(Coding sequence)比较,分析了该片段的构成,将其命名为SIF(SIRT1 Interaction fragment),酵母单杂交(Y1H)技术研究了FOXL2与SIF的结合,凝胶滞缓(EMSA)技术确定其调控的位点,荧光定量PCR(q RT-PCR)对SIRT1在不同组织和性腺发育周期中的表达模式进行了研究,结合SIRT1的序列和保守功能结构域分析,通过白藜芦醇刺激实验对SIRT1的功能进行了初步探索;同时对STARD3的序列和表达模式进行了探究,为该基因的功能研究奠定基础。 论文研究结果如下: (1)SIF总长91bp,起始于SIRT1基因上的一段内含子,含该内含子CATTAG共6bp序列,其余85bp序列位于SIRT1 CDS+1172位～+1257位,结合文献及Ch IP-seq的motif分析,分析SIF中含两个FOXL2结合核心位点,分别命名为SIF1(位于SIF的+28～+35)和SIF2(位于SIF的+53～+60),序列分别为:ACAAATC和CTCAAGA;(2)酵母单杂交实验结果显示,同时转化FOXL2-AD融合蛋白的表达载体和SIF-p His2克隆载体的酵母菌在特定培养基中能正常生长(对照组中酵母不长),表明栉孔扇贝FOXL2蛋白能够与SIF片段结合,从而激活下游报告基因的表达,即FOXL2能直接结合在SIF上从而与SIRT1发生互作;(3)原核表达的FOXL2蛋白包涵体复性(复性后的活性蛋白用于EMSA实验)结果显示,采用透析法复性,FOXL2易蛋白错误折叠而聚集沉淀;采用稀释法复性,FOXL2溶解在上清液中,无沉淀产生,认为稀释法相比透析法更适合该蛋白复性;(4)在上述基础上,进一步通过凝胶滞缓实验体外验证SIF、SIF1和SIF2与FOXL2蛋白的结合,结果显示:仅SIF、SIF1和SIF2三条序列能与FOXL2蛋白结合从而发生凝胶滞缓,将SIF1和SIF2核心位点突变的SIF探针不与FOXL2结合,说明除核心位点外的其他序列不与FOXL2蛋白结合,即FOXL2仅通过SIF1和SIF2两个核心位点与SIRT1相互作用;(5)选择生长期进行各组织表达模式研究,发现SIRT1在不同组织中均有表达,但在卵巢和精巢中表达量显著性高于其他组织(P0.05),呈现性腺相关性,精卵巢中表达差别不大;在不同时期性腺表达模式中,SIRT1 mRNA在卵巢生长期显著高表达(P0.05),在增殖期和成熟期表达量较低;SIRT1 mRNA在精巢生长期与成熟期呈显著性高表达(P0.05),增殖期表达量较低,认为其在卵巢中与卵母细胞生长发育相关性较大,在精巢中与精母细胞发育及精子成熟相关性较大;(6)SIRT1基因CDS长2382bp,编码793个氨基酸,编码的蛋白具有三个保守功能结构:NTERM激活基序、催化活性中心以及ESA结构域;(7)对生长期前期栉孔扇贝注射白藜芦醇(SIRT1激活剂),q RT-PCR结果显示实验组SIRT1表达量显著高于对照组,表明白藜芦醇刺激SIRT1高表达;卵巢组织切片显示实验组卵母细胞数量明显多于对照组,且对照组正常状态下滤泡中出现少量成熟卵子,但实验组未出现。推测SIRT1一方面可以促进卵母细胞增殖,另一方面可以延缓卵子形成,从而在防止卵巢衰老中发挥作用;(8)STARD3基因CDS长1512bp,编码503个氨基酸,含有START和MENTAL 2个主要结构域及FF
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