花椒籽蛋白及多肽的理化性质和生物活性研究

作     者：董思雨 

作者单位：齐鲁工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙欣

授予年度：2024年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：花椒籽蛋白 多肽 理化性质 生物活性 

摘      要：花椒籽蛋白(ZSP)氨基酸组成丰富且合理,ZSP及其多肽具有多种功能特性和生物活性,是一种具有开发潜力的植物蛋白质资源。因此,本文首先以花椒籽为原料,研究了从中提取ZSP的最佳工艺条件,深入研究了 ZSP的基础理化和功能性质、不同蛋白酶水解ZSP所得多肽的功能和生物特性;然后对碱性蛋白酶制得的花椒籽多肽(抗氧化效果好)和胃蛋白酶制得的花椒籽多肽(ACE抑制效果好)分别进行超滤分离,研究不同超滤组分的理化特征、抗氧化和ACE抑制作用。实验所得结果如下: (1)以ZSP提取率为评价指标,通过单因素实验确定料液比、提取温度、提取时间和pH值的响应面试验设计中心值,然后使用响应面法探究最佳提取条件。通过分析回归模型得到理论上提取ZSP的最佳条件为:料液比(花椒籽:水,g/mL)1:36.30,pH 9.06,温度 43.69℃,时间 3.45 h,此时 ZSP 的提取率为 46.12%。从方便操作的角度考虑,最佳条件调整为:料液比(花椒籽:水,g/mL)1:35,pH 9.0,温度45℃,时间3.5 h,经过实验验证,ZSP的提取率为46.54%。 (2)对ZSP的组成和不同酸碱条件下的理化和功能性质进行研究,结果表明,ZSP中氨基酸种类齐全,其中Glu含量最高(16.37 g/100g),由6个主要亚基组成:54、31、25、18、10和9 kDa,其中54、31和18 kDa的条带为糖蛋白。ZSP在pH 5.0时无规则卷曲结构含量高(23.74%),在pH 9.0时β-折叠含量高(30.13%),说明ZSP在pH 9.0时的结构更稳定。在pH 5.0时(等电点附近),ZSP的Zeta电位绝对值小(6.38 mV),静电斥力弱,因此ZSP易于聚集和埋藏疏水基团和巯基,使得ZSP具有高黏度、高热变性温度(90.99℃)和高持水力(3.6750 g/g),但是降低了 ZSP的起泡能力和乳化能力。相反,在碱性环境中时ZSP具有高的溶解度(65.59-68.59%)和乳化性(31.53-83.90 m2/g)。本研究结果为ZSP在不同酸碱条件下的食品中使用提供了基础信息。 (3)通过对不同蛋白酶水解的花椒籽多肽进行理化、功能和生物活性进行研究对比,结果发现,五种蛋白酶水解均减小了 ZSP的平均粒径和分子量,但是增加了无规则卷曲结构的含量,因此结构松散。胃蛋白酶对ZSP的水解程度最高(24.07%),得到的多肽分子量最小(13 kDa)、平均粒径最小(129.80 nm)、溶解度最高(98.9%)。而碱性蛋白酶制备的花椒籽多肽具有最高的表面疏水性和起泡能力(88.89%),以及最低的泡沫稳定性(45.00%)。此外,使用碱性蛋白酶制备的花椒籽多肽具有最低的清除羟基(1.94)、DPPH(0.28)、ABTS(0.13)自由基和螯合Fe2+(0.61)的IC50值(mg/mL)。使用胃蛋白酶制备的花椒籽多肽显示出最高活性的抑制血管紧张素转换酶(ACE)的效果(IC50=0.54 mg/mL)。本研究结果为花椒籽多肽用作抗氧化剂和降压剂提供了支持。 (4)将胃蛋白酶和碱性蛋白酶制备的花椒籽多肽经超滤得到四个不同分子量范围(10-30 kDa、5-10 kDa、3-5 kDa和3 kDa)的多肽组分,分别对上述组分和超滤前的多肽进行理化和体外抗氧化、ACE抑制活性进行研究。结果表明,相比于超滤前的胃蛋白酶和碱性蛋白酶水解的多肽(33.86 g/100g、34.92 g/100g),超滤后各组分(34.05-40.15 g/100g、34.84-36.83 g/100g)的必需氨基酸含量增加。分子量为5-10 kDa的花椒籽多肽表现出最好的抗氧化活性,IC50值(mg/mL)分别为:4.24、1.87(羟基自由基清除);0.86、0.21(DPPH自由基清除);0.73、0.26(ABTS自由基清除);3.55、0.56(Fe2+螯合)。而分子量3 kDa的花椒籽多肽表现出最高的ACE抑制活性,IC50值(mg/mL)分别为0.32和0.40。此外,超滤处理使花椒籽多肽的β-转角结构的含量降低,无规则卷曲结构含量增加,而α-螺旋结构的含量无明显变化。碱性蛋白酶水解的花椒籽多肽及其超滤组分(34.57-39.46%)中β-折叠结构的含量高于胃蛋白酶水解的花椒籽多肽及其超滤组分(25.59-30.32%)。本研究结果为花椒籽多肽的应用提供了更深一步地理论支撑。