超声辅助酶解制备核桃ACE抑制肽及抑制机理研究

作     者：唐恒宽 

作者单位：北京林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王丰俊

授予年度：2022年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：超声 核桃蛋白 ACE抑制肽 生物信息学 分子对接 

摘      要：核桃作为我国重要的经济作物,含有丰富的油脂和蛋白质,营养价值较高,深受消费者的喜爱。本研究以核桃粕为原料,采用超声对蛋白进行预处理,研究超声时间和功率对核桃蛋白性质和核桃多肽ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性的影响,然后分离纯化ACE抑制肽,并研究其抑制机理和药代动力学特性,最后分析特定氨基酸种类对ACE抑制肽性质的影响。研究具体内容和结果如下:(1)对核桃蛋白进行超声预处理,研究超声时间和功率对核桃蛋白粒径和电位、粒径分布、荧光光谱、表面疏水性和多肽ACE抑制活性的影响。结果表明,在最佳的超声时间和功率条件下,蛋白的粒径分别减小约60.8%和71.37%;溶解度分别增加约15.4%和22.1%;荧光强度分别增加约13.7%和13.6%;表面疏水性分别增加约23.8%和31.4%;酶解经超声处理后的蛋白得到的酶解液的ACE抑制活性也增加约17.9%和16.5%。实验结果表明超声可以改善核桃蛋白的性质和功能。(2)对超声预处理后的核桃蛋白酶解液中的ACE抑制肽进行分离纯化和鉴定。首先酶解液经过超滤分离得到W-1(MW10k Da)三个组分;由于W-1组分的ACE抑制率最高为85.57±0.42%,故将W-1组分通过离子交换色谱进一步分离得到W-1-1、W-1-2、W-1-3和W-1-4四个组分,其中W-1-1组分的抑制活性最高为86.22±1.01%。然后对W-1-1组分的多肽进行质谱鉴定得到1025条肽序列,其中四肽有296条,占比最高。最后经过多肽的毒性、ACE抑制活性、水溶性和抗消化能力的预测,从所有肽段中筛选得到IYQ和YIQ两条ACE抑制肽。(3)合成筛选得到的多肽IYQ和YIQ,测定其ACE抑制活性并对抑制机理和物理化学性质进行表征。首先合成了纯度分别为99.95%和99.98%的抑制肽IYQ和YIQ,测定其两条肽段的ACE抑制率分别为95.5±0.1%和82.12±1.7%。然后分子对接分析发现YIQ与ACE形成7条氢键,全部位于ACE活性中心,而IYQ与ACE活性位点的结合有限,在体外IYQ也表现为反竞争性抑制。最后分析了YIQ和IYQ参与人体内药物代谢的情况和温度稳定性,结果表明YIQ和IYQ与ACE在人体内结合概率较小。IYQ在4°C和25°C温度条件下稳定,但在50°C和80°C条件下会出现抑制活性下降的现象。(4)对已报道ACE抑制肽进行分析,基于BIOPEP数据库对IYQ中间氨基酸进行替换,并对替换得到的多肽性质进行表征。首先经过数据库分析,发现Pro、Leu和Lys等是ACE抑制肽中常见的氨基酸,然后对IYQ中的氨基酸进行替换得到IPQ、ILQ和IKQ三条新的ACE抑制肽。最后测定了替换肽的各项性质,结果表明替换肽的ACE抑制率分别为89.5±0.1%、68.5±0.1%和98.12±1.7%,抑制活性变化明显;且IKQ与ACE活性中心形成的氢键数量增加,同时与人体内ACE的结合概率提高到21.7%,温度稳定性也显著增强。