圆红酵母利用粗甘油生产单细胞油脂的研究

作     者：宋宝财 

作者单位：南京理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李晶

授予年度：2023年

学科分类：081702[工学-化学工艺] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：圆红酵母 实验室适应性进化 代谢组学 发酵 粗甘油 细胞破碎 

摘      要：生物柴油作为可再生的生物质燃料所具有的独特优势,包括燃烧后几乎不会产生有毒污染物等,有助于我国实现“双碳目标。以传统油料（植物油）为原料生产生物柴油,面临生产成本和“与人争粮,与人争地的问题,而单细胞油脂作为新型油脂原料,油脂组成类似于植物油有利于生产生物燃料。因此,近年关于产油微生物的研究受到越来越多研究人员的重视。其中圆红酵母作为产油率较高的物种,而且能够利用廉价碳源粗甘油为底物生产微生物油脂,可以降低生产成本和减少环境污染问题,表现出良好的工业化应用潜力。本研究以一株油脂降解能力弱化的圆红酵母基因工程菌Rhodotorula ***3为出发株。首先通过实验室适应性进化方法驯化筛选出一株耐受较高浓度甲醇的驯化株,并通过发酵实验结合代谢组学方法,分析其在甲醇中的代谢和发酵性能差异。随后对驯化株以粗甘油为碳源进行发酵性能测试以及发酵条件的优化,最后分析了酶解法与超声波破碎两者单独或联合使用对油脂提取率的影响,主要结论如下: （1）以甲醇作为抑制因子通过实验室适应性进化处理出发菌株GX3,筛选出一株能够耐受较高浓度甲醇的驯化株O3A2。利用H NMR代谢组学技术分析驯化株O3A2与出发菌株GX3在菌体生长期和油脂合成期的代谢差异,共鉴定出36种代谢物。在菌体生长期驯化株O3A2的TCA循环加强,显示出更高的细胞生长率,而在油脂合成期,驯化株表现出更高的油脂生产率。在含甲醇的培养基中分批发酵96 h,相比于出发株,O3A2油脂产量提升了31.39%,达到7.06±0.45 g/L,其中十六碳和饱和脂肪酸相对含量分别增加了2.73%和1.51%。 （2）驯化株O3A2利用粗甘油作为唯一碳源分批培养,发酵至96 h油脂产量可以达到7.16±0.08 g/L,生产强度为0.075 g/L/h。之后添加1 g/L碳酸钙发酵至120 h后油脂产量比未添加组提升了92.59%,此时的油脂产量和生产强度分别达到14.19±0.34 g/L和0.118 g/L/h。然后利用响应面方法对培养条件进行优化,优化后培养60 h生物量可达到12.37±0.35 g/L。最后建立了红酵母O3A2两阶段转化粗甘油产单细胞油脂工艺,通过二级种子富集的细胞转化粗甘油生产油脂,转化72 h油脂产量和胞内油脂含量分别达到了13.64±0.53 g/L和51.94±1.60%,转化油脂生产强度为0.109 g/L/h。 （3）通过单因素实验确定酶解法中β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶比例在2:1及酶解时间延长至24 h时,油脂提取率达到酸热法的73.07±2.37%。对于超声波破碎,处理时间越长细胞破碎率越高,符合一级破碎动力学特征,当处理时间40 min时,油脂提取率达到酸热法的57.66±2.70%。随后,通过酶解12 h加超声波破碎20 min,油脂提取率可以达到油脂提取率可以达到95.39±2.07%,其油脂组成中十六碳脂肪酸和饱和脂肪酸的相对含量相比于酸热法分别增加1.09%和1.27%,而且通过流式细胞术和共聚焦显微镜观察酵母细胞能保留较完整的细胞碎片。