脑心通方干预心肌梗死后神经炎症的药效学评价及机制探讨

作     者：常梦丽 

作者单位：中国中医科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：唐仕欢

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：心肌梗死 小胶质细胞 神经炎症反应 蛋白质组学 脑心通方(胶囊) 

摘      要：研究背景心脑血管疾病临床表现复杂,死亡率高,疾病负担重。心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后引发卒中、认知功能障碍、抑郁等脑部并发症,大大加重了临床死亡率及治疗难度,其治疗成为一个亟待解决的难题,但是目前对于MI后引起脑部疾病的中间介质及机制尚不清楚。已有研究表明,MI引起炎症反应、氧化应激、自噬等多个病理环节的激活,导致脑部神经炎症反应的发生,且伴随心肌缺血时间的延长,脑部出现持续的神经炎症反应,不仅会引发神经毒性,造成神经元损伤,促进神经退行性疾病的发生,还会使交感神经兴奋性增强,导致恶性心律失常的发生。因此,揭示MI后出现神经炎症反应的病理机制,将为心脑共病的防治提供有效途径。神经炎症反应参与多种神经系统疾病的发病机制,由中枢神经系统内主要的免疫细胞—小胶质细胞驱动。一方面,小胶质细胞参与中枢神经系统发育,包括调节神经突触形成、修剪突触、吞噬和清除因程序性细胞死亡的神经元,帮助维持脑内环境稳定;另一方面,脑部出现损伤时,小胶质细胞发生表型变化,迅速增殖,促进神经炎症反应发生。但是,过度激活的小胶质细胞则会造成持续的神经炎症反应,促进神经退行性疾病等神经系统疾病的发生。因此,小胶质细胞常作为神经系统疾病的主要研究对象,而离子化钙结合适配器分子1(Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule 1,IBA-1)作为小胶质细胞标记物,被广泛用来研究脑部神经炎症反应。对心脑之间的关系,中医认为,“神明之体藏于脑,神明之用发于心,元神在脑,识神在心,心脑息息相关。脑之神明伤,累及于心,心之神明伤,累及于脑。在治疗上,中医强调“脑心同治。脑心通方(胶囊)是“脑心同治的代表方剂,临床广泛用于缺血性心脑血管疾病的治疗,疗效可靠。因此,可用于心脑共病的研究。为探究MI后出现神经炎症反应的病理过程及机制,本研究拟利用IBA-1标记MI大鼠脑部的小胶质细胞,检测神经炎症反应的变化,筛选MI后脑部出现神经炎症反应的时间点;利用蛋白质组学技术探究MI后神经炎症反应相关的蛋白网络,并以脑心通方(胶囊)为探针,通过解析方剂作用的效应分子,揭示MI后神经炎症反应的关键蛋白,同时帮助阐释脑心通方(胶囊)“脑心同治的药效作用机制。研究内容1.对MI后出现神经炎症反应的时间点进行研究。采用大鼠冠状动脉左前降支结扎模型,对MI后1、3、5、7d四个时间点的大鼠心脏组织进行病理染色,对脑组织进行小胶质细胞的免疫荧光标记,评价神经炎症反应,确认MI后脑部最早出现神经炎症反应的时间点。2.基于蛋白质组学技术的MI后心脏组织和大脑皮层组织的差异蛋白分析。根据前期结果,选择MI后1、3、7d三个时间点,利用DIA蛋白质组学技术分析MI后心脏组织和大脑皮层组织的蛋白表达量变化,通过生物信息学分析,寻找差异表达蛋白,初步筛选与MI后神经炎症反应发生相关的差异蛋白。3.通过脑心通方(胶囊)对MI后神经炎症反应的药效学评价和机制探究揭示MI后出现神经炎症反应的关键蛋白及脑心通方(胶囊)的关键作用分子。以人体等效剂量为脑心通方(胶囊)中剂量,以1/2和2倍的人体等效剂量为低剂量和高剂量,对SD大鼠预给药7 d后进行MI模型构建,分别于术后1d和7 d取材。通过心脏梗死面积、组织病理染色和IBA-1标记脑部小胶质细胞进行脑心通方(胶囊)的药效学评价;选择最佳给药剂量,并基于DIA蛋白质组学技术探究脑心通方(胶囊)的药效作用分子,结合第二章的蛋白网络结果进行核心蛋白的筛选和验证。研究结果***后脑部出现神经炎症反应心脏组织HE染色和Masson染色结果表明,MI后1 d,左心室组织出现炎性细胞浸润,MI后3d心肌组织开始出现蓝染胶原纤维,且随着缺血时间延长,纤维化面积逐渐增大,心肌损伤加重,表明由心肌梗死逐渐发展为心肌纤维化。脑组织病理染色结果表明,大脑并未出现显著的细胞损伤;免疫荧光染色结果表明,MI后1d,IBA-1的表达在皮层出现显著性升高,MI后3d表现为增加的趋势,并在MI后5 d、7 d维持高表达状态,表明小胶质细胞激活,脑部出现神经炎症反应。***后出现神经炎症反应的差异蛋白网络构建MI后1、3、7d的心脏组织蛋白质组学结果表明,随着缺血时间改变,差异蛋白的表达量发生变化,其功能涉及炎症反应、氧化应激、心肌纤维化等多个病理过程;大脑皮层组织有少量蛋白表达量被上调,且在不同时间点发生动态变化,蛋白功能涉及补体凝血级联反应、线粒体转运、细胞粘附等生物学过程。心脑之间的差异蛋白存在互作关系,表明心脑之间存在潜在的关键蛋白。通过与脑部疾病进行关联,筛选与神经炎症相关的差异蛋白,得到17个差异蛋白:蛋白补体C3(C3-beta-c,C3)、补体成分 4-结合蛋白(C4b-binding protein alp