RpoS和RpoN对鼠伤寒沙门菌重要生物学特征的影响及其调控作用研究

作     者：李鑫鸽 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋宏彬

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：RpoS RpoN 抗逆生长 生物膜 蛋白质组学 

摘      要：目的:1.研究转录调控因子RpoS与RpoN在鼠伤寒沙门菌抗逆生长、生物膜形成能力、毒力等方面的调控作用,探究二者调控关系,为进一步对鼠伤寒沙门菌进行抗菌治疗提供支持。2.通过对鼠伤寒沙门菌进行抗逆条件下的蛋白质组学分析,探究RpoS与RpoN两个调控因子间的通路关联,为研究σ因子家族间调控关系提供参考。方法:1.选择SH15SF175鼠伤寒沙门菌为研究对象,通过CRISPR方法构建rpo S基因敲除株和rpo Srpo N双基因敲除株,通过菌落PCR和m RNA表达水平进行验证。2.通过对敲除前后菌株在不同p H、渗透压、氧应激、低水分子活度、干燥条件下的生长情况进行测定,评估菌株抗逆生长能力变化;采用结晶紫染色法、激光共聚焦显微镜观察法以及刚果红培养基培养法进行生物膜形成能力的评价;通过鞭毛相关基因的m RNA表达水平、运动性实验和Hela细胞对细菌的黏附和侵袭实验来评价敲除前后菌株毒力特征变化;采用Biolog生化鉴定进行生化反应比较分析。3.采用DIA蛋白质组学对野生株与SF175?rpo S、SF175?rpo Srpo N的蛋白质产物进行鉴定,通过结构域分析和GO功能分析对差异蛋白质功能进行描述,通过KEGG通路分析找到主要差异蛋白质通路。结果:1.通过菌落PCR和m RNA表达水平的方法验证了SF175?rpo S和SF175?rpo Srpo N构建成功。2.结晶紫染色法测定生物膜实验结果显示SF175?rpo S和SF175?rpo Srpo N较野生株生物膜形成能力均减弱,在28℃条件下,SF175?rpo Srpo N生物膜形成能力较SF175?rpo S有所增强。3.刚果红实验发现SF175?rpo S和SF175?rpo Srpo N较野生株纤维素含量明显下降,但SF175?rpo S和SF175?rpo Srpo N之间形态并无明显差异。4.毒力实验结果显示SF175?rpo S的黏附率增加,侵袭率降低,SF175?rpo Srpo N的黏附率和侵袭率均降低。5.生化鉴定结果显示10种生化反应值发生改变,其中两个敲除株对应的8个孔的细菌生化反应值较野生株降低,2个孔较野生株升高,且SF175?rpo Srpo N的生化反应值高于SF175?rpo S。***蛋白质组学数据显示面对高渗环境,SF175?rpo S、SF175?rpo Srpo N较野生株在海藻糖6-磷酸合成酶(Ots A)的表达上出现显著下调,结构域预测分析显示差异蛋白质主要在ABC转运子和响应调节接收子,GO功能分析显示28℃高渗条件下SF175?rpo Srpo N和SF175?rpo S的蛋白差异最显著的通路是谷氨酰胺家族氨基酸生物合成,KEGG通路分析表明28℃高渗条件下SF175?rpo S和SF175?rpo Srpo N差异蛋白通路最显著的是精氨酸合成通路。结论:1.本研究证实了rpo S敲除后,细菌在不同环境压力下的生长能力和生物膜形成能力和毒力作用均有所减弱,显示rpo S在应对环境胁迫、生物膜形成和毒力方面时起到十分重要的调控作用。2.本研究发现rpo S和rpo N在不同环境压力、生物膜形成及毒力方面都发挥了重要的调控作用,且均显示出不同的调控方向。3.本研究蛋白质组学分析显示rpo S通过ots A,rpo N通过hpf共同参与应对高渗环境压力,精氨酸合成通路可能是28℃高渗环境下rpo S和rpo N共同参与调控的重要机制之一。