壳聚糖-聚乙二醇-多肽偶联物治疗真菌性角膜炎的作用及性能研究

作     者：武丽萍 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵少贞

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：真菌性角膜炎 壳聚糖-聚乙二醇-多肽偶联物 生物安全性 角膜通透性 治疗作用 

摘      要：目的:真菌性角膜炎作为一种难治且致盲率高的感染性角膜病,其目前首要治疗手段为局部药物治疗,但现有抗真菌药物存在分子颗粒大、疏水性强、水溶性差等问题使其难以穿透角膜全层组织,对深部感染难以进行有效控制。壳聚糖-聚乙二醇-多肽偶联物（CPL）是一种能够在水相环境和疏水磷脂环境中发生不同结构转变的高分子材料,该特性有利于其在角膜多层亲疏水交叉环境中通透转运。本研究将评价CPL的体外抗菌及角膜通透性能、生物安全性及对白色念珠菌性角膜炎的治疗作用。方法:1、选取白色念珠菌为检测菌株,利用微量肉汤稀释法测定CPL对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）,并换算为实际多肽LK浓度;将白色念珠菌与CPL作用2h后,扫描电子显微镜（SEM）下观察白色念珠菌形态,对CPL的杀菌机制进行初步探究。2、利用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测CPL对人角膜上皮细胞（HCECs）的毒性作用;利用兔血红细胞测定CPL对哺乳动物的红细胞溶血能力。3、成年雌性新西兰白兔用来测定CPL的眼表刺激性,于末次点药后1h、12h、24h、48h、72h裂隙灯下观察每组兔眼有无刺激症状,并于规定时间点处死兔子,取其角膜组织做HE染色,光镜下观察角膜组织的病理学改变。4、新西兰大白兔离体角膜测定CPL的角膜通透性,将角膜分为去上皮和上皮完整组,分别置于垂直扩散池（Franz Cell）的扩散区域内,一定时间后从扩散池中取下角膜组织,结合激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）对离体角膜组织进行逐层扫描,观察CPL在不同上皮屏障下角膜组织中的分布情况。5、分别建立白色念珠菌性角膜炎浅层模型及深层模型,测定CPL对于不同深度的真菌性角膜炎的治疗作用,用药期间每天裂隙灯显微镜下观察各组角膜溃疡及结膜充血情况,分别于1、3、7、14、21、28天行裂隙灯照相并对每只兔子眼表感染进行评分,同时观察并记录各组角膜病灶区的愈合情况及时间。结果:1、CPL对白色念珠菌的MIC为8μg/m L（换算为实际多肽浓度）,具有良好抗菌能力。而单纯多肽LK对于白色念珠菌的MIC为32μg/m L;且CPL可以通过破膜杀菌的机制对白色念珠菌进行抑制。2、细胞毒性实验显示,64μg/m L的LK对人角膜上皮细胞增殖表现出抑制作用,而含有相同多肽浓度的CPL对人角膜上皮细胞起到促增殖作用3、新西兰白兔眼表刺激性实验显示,与单纯多肽LK相比,CPL未见明显的眼表刺激性表现。4、离体角膜通透性评价显示,在给药22小时后,共聚焦显微镜示CPL可以在去上皮角膜和上皮完整角膜的深部组织分布。5、真菌性角膜炎治疗作用结果显示,浅层模型造模后3天内,角膜溃疡、水肿均表现出加重过程。造模后第7天至第28天,与生理盐水组、LK组及那他霉素组相比,CPL组角膜溃疡及炎症浸润程度呈明显缩小愈合趋势,且期间未见明显新生血管长入角膜组织,CPL眼表感染评分明显低于其他三组（P0.05）;浅层溃疡愈合时间比较,CPL组愈合时间较生理盐水组、LK组和那他霉素组愈合时间明显缩短（P0.05）。深层模型造模后第3天,生理盐水组、CPL组和那他霉素组的角膜灰白色溃疡及浸润深度均较前扩大;造模后第14天至第28天,与生理盐水组及那他霉素组相比,CPL组角膜溃疡,浸润深度呈缩小愈合趋势,伴新生血管长入和角膜斑翳形成,观察期间CPL组眼表感染评分明显低于其他两组（P0.05）;深层溃疡愈合时间比较,CPL组愈合时间较生理盐水组与那他霉素组愈合时间明显缩短（P0.05）。结论:CPL能通过破膜杀菌机制抑制白色念珠菌,并且可以实现在离体角膜深层分布,对白色念珠菌所致的浅层及深层角膜炎模型具有良好的治疗效果,且生物安全性好、眼表刺激性小。