荧光可视化研究癌细胞中miRNA-34a的作用及其对细胞凋亡的影响

作     者：陈哲 

作者单位：齐鲁工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：栾明明

授予年度：2024年

学科分类：081704[工学-应用化学] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 100214[医学-肿瘤学] 0703[理学-化学] 10[医学] 

主      题：miRNA-34a 凋亡蛋白Caspase-3 荧光纳米探针 癌细胞 

摘      要：癌症时刻威胁着人类健康,是全世界人们面对的共同挑战。已有研究表明癌症的发生发展与miRNA的异常表达密切相关,基于miRNA靶向治疗是肿瘤精准治疗的一个热点领域。根据miRNA在不同癌细胞中发挥的作用不同,其可以分为致癌基因和抑癌基因。但将miRNA简单地分类为肿瘤抑制因子或致癌miRNA实际上可能具有误导性,因为有些miRNA的表达量、所发挥的致癌或抑癌作用依赖于具体的细胞类型。例如,miRNA-34a已被证明在多数情况下具有肿瘤抑制作用,但有些研究则表明发挥的是致癌作用。此外,大量研究证明,miRNA的表达量变化往往会涉及到细胞中多种信号通路的激活,从而影响肿瘤凋亡、侵袭、转移等重要过程。经典的p53细胞通路,在肿瘤抑制中起着核心作用,p53通路能够通过多重转录靶基因对肿瘤抑制作用,其中就包括与miRNA-34a共同参与抑制癌细胞的增殖。因而,在发展基于miRNA的癌症精准治疗中,有必要研究确定miRNA发挥的具体作用、信号通路对miRNA的调控及miRNA表达量变化对细胞凋亡过程的影响。对于精准评估miRNA靶向治疗效果,推进癌症患者的个性化精准治疗具有科学的研究价值。 传统的生物学检测方法存在操作繁琐、价格昂贵等难以避免的缺陷,随着荧光纳米探针成像策略的应运而生,该策略在疾病相关的生物小分子检测领域显示出巨大潜力。本文基于聚多巴胺纳米颗粒(PDA NPs)设计并制备两种新型的荧光纳米探针,用于活细胞水平对miRNA-34a和凋亡蛋白Caspase-3进行同时可视化监测,以确定miRNA发挥的具体作用、信号通路对miRNA的调控及miRNA表达量变化对细胞凋亡的影响。本论文包括以下两个体系的研究: 1、设计了以PDA NPs为载体的新型荧光纳米探针,PDA NPs通过π-π堆积和静电相互作用吸附Texas Red标记的分子信标(MB)和Cy5标记的肽链(peptide),得到功能化的纳米探针(Nanoprobe),该探针能够特异性识别miRNA-34a和Caspase-3,可用于同时成像检测活细胞中的miRNA-34a和Caspase-3,通过研究二者表达量变化以明确miRNA-34a在癌细胞中发挥的作用。在有争议的宫颈癌(Hela)和乳腺癌(MCF-7)细胞经不同药物处理后,该探针以一种简单可视化的方法,用于确定miRNA-34a均发挥了肿瘤抑制基因的作用。本方法也可拓展用于明确其他有争议miRNA所发挥的致癌或抑癌作用,这对研发以miRNA为靶点精准治疗和评估抗癌新药的疗效具有重要的指导意义。 2、为了进一步探究以miRNA-34a为靶点的癌症诊疗机制及细胞内通路变化对凋亡影响,我们以PDA NPs为载体设计并制备了一种新型荧光纳米探针。该探针首先通过含有GC碱基的MB与阿霉素(DOX)特异性结合得到MB(DOX),PDA NPs再逐级修饰MB(DOX)和peptide,得到功能化的荧光纳米探针(PDA-MB(DOX)-Pep),MB和peptide能特异性识别miRNA-34a和Caspase-3。该探针通过靶向miRNA-34a可以释放DOX药物以激活细胞通路p53,p53的激活又能循环诱导miRNA-34a和凋亡蛋白Caspase-3的表达。该探针通过成像检测miRNA-34a和凋亡蛋白二者的变化,可视化研究了药物对p53通路激活及通路中miRNA和细胞凋亡的影响机制。该探针提供了一种可视化策略用于研究药物对通路激活以及通路中miRNA和细胞凋亡的主要影响机制,推动基于miRNA的精准治疗具有深远的科学研究价值,并展现出巨大的临床应用潜力。