基于小型RNA结合蛋白Csy4的新型迷你基因组编辑系统的研究

作     者：邓嘉辉 

作者单位：新疆农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘晓东

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：蛋白质与RNA结合的验证技术 迷你基因组编辑系统 Csy4 dCas9 FokI 

摘      要：近年来,CRISPR/Cas系统以其出色的表现在植物分子育种、人类遗传疾病治疗、基因功能研究和作物遗传改良等领域迅速发展。其中,CRISPR/Cas9系统因其高效、灵活、成本低、特异性高等优点成为目前最流行的基因组编辑系统。但该技术在应用时仍存在一些缺陷,如存在较高的脱靶率,核酸酶蛋白尺寸过大,受PAM位点限制等问题。为解决这些问题,本研究基于一种小型RNA结合蛋白Csy4,在拟南芥中拟建立Csy4的新型迷你基因组编辑系统,同时尝试建立一种简易的蛋白质与RNA结合的酵母验证体系,为基因组编辑系统工具箱中增加新成员。主要研究结果如下:(1)构建了dCas9与sgRNA结合和Csy4与sgRNA结合的酵母验证体系相关载体,利用酵母单杂交实验技术的原理,在酵母细胞中检测到了RNA结合蛋白dCas9-AD和Csy4-AD与对应sgRNA结合,成功地激活了GL2-p HIS2载体上报告基因的表达,初步建立了一种简易的蛋白质与RNA结合的酵母验证体系。(2)对sgRNA上与dCas9结合的可能功能位点Repeat-Loop1和Loop2-Loop3的结构进行定点突变,构建了sgRNA-Cas9定点突变酵母杂交实验载体;对sgRNA上与Csy4结合的可能功能位点CL、CR、RR结构进行定点突变,构建了sgRNA-Csy4定点突变酵母杂交实验载体。通过酵母单杂交实验验证发现,GL2-p HIS2与dCas9-GL2-Loop1-p GADT7、dCas9-GL2-Loop2-Loop3-p GADT7、Csy4-GL2-CL-p GADT7、Csy4-GL2-CR-p GADT7和Csy4-GL2-RR-p GADT7质粒组合的缺陷型酵母在Leu-Trp-His缺陷型培养基上能够正常生长。研究结果初步表明Repeat-Loop1和Loop2-Loop3对sgRNA与dCas9的结合并不重要;CL、CR、RR结构对sgRNA与Csy4的结合也不重要。(3)采用AlphaFold2预测了Csy4-FokI和FokI-Csy4融合蛋白的结构,结果显示融合蛋白中FokI和Csy4都各自保持着自身原有的三维结构,表明它们都能正常发挥彼此的功能。构建靶向敲除拟南芥At CLA1基因的7个CLCrV介导的不同中间间隔区的双靶位点Csy4-FokI编辑载体,利用拟南芥叶片注射的方法进行CLCrV介导的Csy4-FokI与FokI-Csy4编辑系统的验证。通过HI-TOM高通量测序检测新型迷你基因组编辑系统的编辑能力,结果显示,CLCrV介导的Csy4-FokI迷你基因组编辑系统能够实现对目标基因进行靶向编辑。本研究成功构建了Csy4-FokI新型迷你基因组编辑系统,为克服CRISPR/Cas基因组编辑技术存在的问题提供了一种新的解决方案。