Segatella bryantii中多功能糖苷水解酶酶学性质及催化机制研究

作     者：赵鑫 

作者单位：内蒙古科技大学包头师范学院 

学位级别：硕士

导师姓名：门中华;温彤

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：β-1,4-内切葡聚糖酶 β-甘露聚糖酶 基因挖掘 异源表达 无缝克隆 

摘      要：作为植物细胞壁的主要成分,纤维素、半纤维素等多糖在地球上储量极大,是最为丰富的生物资源之一,由于具有来源广泛、再生性强等诸多优势,这类物质为生物能源转化、生物饲料发酵及微生物规模化生产提供了理想基质。然而,由葡萄糖单体通过β-1,4-D-糖苷键相连而形成的纤维素分子排列致密,加之纤维素、半纤维素等分子间通常聚集形成网状结构和结晶区,稳定性极高,导致以纤维素类生物质为基质的高附加值产品生产受到极大制约。 利用糖苷水解酶催化纤维素等多糖高效转化为易利用单糖,是提升其附加值的有效途径。在漫长的进化历程中,演化出了种类繁多,能够特异性水解各类天然多糖的糖苷酶。植物生物质的降解通常需要多种水解酶协同作用。其中,β-1,4-内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanohydrolase)是纤维素酶系中一个关键组分,它主要通过随机切割纤维素链内的β-1,4-糖苷键,从而将纤维素的非结晶区切开,将其分解成还原性寡糖。β-甘露聚糖酶(β-mannanase)是半纤维素水解酶系中的一种糖苷水解酶,它主要以内切的方式随机切割β-1,4-糖苷键,形成具有还原端的寡糖。本研究旨在利用生物信息学预测、异源表达、定点突变等技术对筛选自天然环境中的多功能糖苷水解酶进行酶学性质及催化机制解析,从而进一步丰富糖苷水解酶酶库。研究结果如下: 1.首先对反刍动物瘤胃中高丰度微生物Segatella bryantii基因组进行分析,筛选具有典型糖苷水解酶保守序列的编码基因,通过编码产物结构域分析,最终选取了一条编码包含多个功能结构域蛋白的基因序列,并命名为Seg-endo,该基因所表达蛋白整体呈现亲水性,为胞内可溶性游离蛋白。蛋白网络互作显示,该蛋白可能具有多种糖苷水解酶功能。对利用大肠杆菌异源表达获得的Seg-endo进行初步催化活性研究,表明该酶主要具有β-1,4-内切葡聚糖酶酶活、β-甘露聚糖酶酶活,其中该酶在20-50℃条件下保温30 min,仍剩余60%以上的β-甘露聚糖酶酶活,具有潜在的工业应用价值。 2.利用生物信息学手段对Seg-endo基因进行保守基序与结构域预测,并利用大肠杆菌对各潜在活性结构域进行分段表达。菌株底物水解能力检测结果表明只有Seg-endo表达菌能够在LB-CMC平板中降解底物形成水解圈,且外圈与内圈之比EI(D/d)为2.783,表明该蛋白具有β-1,4-内切葡聚糖酶。Seg-endo及与全长序列中糖苷水解酶GH26家族高度同源的Seg-GH26区段表达菌均能够在LK平板中降解底物形成水解圈,且EI(D/d)分别为4.83、19.8,后者为前者4.10倍证明二者均具有β-甘露聚糖酶活性,且GH26家族片段活性显著高于全长序列。酶活测定结果显示,经过亲和纯化和脱盐后得到纯化的Seg-GH26β-甘露聚糖酶活力为436.2554 U/m L,蛋白浓度为0.2117 mg/m L,比酶活为2060.7247 U/mg。 3.通过活性中心预测网站对Seg-GH26蛋白进行预测,结果显示Seg-GH26蛋白164与275位的谷氨酸(E)为潜在活性位点,分别构建两谷氨酸位点突变为丙氨酸(A)位点的单/双点突变异源表达菌。纯化后的三种点突变蛋白对刺槐豆胶的催化活性几乎为零。Seg-GH26与突变株水解圈实验表示,只有Seg-GH26具有水解圈,Seg-GH26的水解圈EI值为突变株的19.80倍。 研究得到了含有多种酶活的Seg-endo糖苷水解酶,并按照结构域与保守基序的预测,对其进行了酶分子改造,最终找到了活性中心与关键位点。本研究丰富了β-1,4-内切葡聚糖酶与β-甘露聚糖酶的工业应用选择,也为其工业应用提供了理论基础。