基于高分辨质谱技术对兴奋剂生长激素泛素化修饰的探究

作     者：章秀兰 

作者单位：上海体育学院 

学位级别：硕士

导师姓名：徐昕;单圆鸿

授予年度：2023年

学科分类：01[哲学] 0101[哲学-哲学] 010105[哲学-伦理学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：兴奋剂 生长激素 泛素化 高分辨质谱技术 

摘      要：研究目的:生长激素(Growth hormone,GH)及其类似物作为内源性肽类禁用物质,因其滥用程度高,检测难度大而受到持续关注。目前,生长激素兴奋剂的检测方法包括直接检测法和间接检测法。直接检测法是基于人体内GH不同亚型比例变化超过一定阈值,进而判断GH的摄入。该检测方法灵敏度高,但是检测窗口期短,仅能在24 h内判出阳性结果。间接检测法则通过两个生物标志物浓度的异常升高判定阳性结果。该方法检测窗口期长,但是阈值较高,存在一定的漏检率。在兴奋剂领域,关于GH的检测目前都是基于人在注射GH后,GH的刺激导致人体“异常的反馈,进而判断GH的摄入,但是这都是基于人群得到的“正常范围,不能排除个体化差异导致的异常结果。本研究从GH被认作兴奋剂的本质出发,人体在生理状态下可以分泌GH,而运动员检测GH的本质是外源性GH,即非自身产生的GH。基于此,本研究从重组人生长激素(recombinant human Growth Hormone,rhGH)药物出发,探究rhGH药物的结构与人体内源性GH的本质区别,由于外源性GH与内源性22 kD-GH的氨基酸序列一致,因此本研究从翻译后修饰入手,探究rhGH药物的翻译后修饰,判断其成为阳性指标的可能性。研究方法:本论文由两个研究组成,其中健康受试者人体实验部分,已通过上海体育学院伦理道德委员会审批。研究一:rhGH泛素化修饰的探索基于高分辨质谱技术,通过还原烷基化、溶液内酶解的方式得到不同的肽段,“从下而上鉴定蛋白。使用不同的软件探索、匹配rhGH药物的翻译后修饰并用标准品确认。通过文献检索初步得到内源性GH翻译后修饰的结果。研究二:多种生理状态下人体内源性GH的泛素化情况探究通过样本量计算,纳入24名健康受试者,在完成规定的实验要求(熟睡、跑步6 km)前后进行采血,得到血清样本,摸索方法检测血清内泛素化的GH,确认多种生理状态下人体内源性泛素化的GH的存在。研究结果:研究一,将质谱结果通过不同的软件匹配以及标准品比对,检出不同品牌的rhGH药物含有相同的2个位点的泛素化修饰。通过文献检索,人体血清内含有泛素化修饰的GH,单纯通过人体内有泛素化的GH不能判断为兴奋剂GH阳性。研究二,将多种生理状态的下的人血清样本的质谱结果与不同的软件匹配以及标准品比对,确认人体内含有泛素化的GH,与rhGH药物有相同的泛素修饰位点。研究结论:(1)基于“自下而上的高分辨质谱蛋白检测技术,首次在已上市两种rhGH药物中发现了多位点的泛素化修饰,其中K96位点泛素化修饰同时存在于两种rhGH药物中。(2)多种生理状态下人血清中的内源性GH也可检出低比例的泛素化修饰。(3)GH泛素化普遍存在于内源性GH和rhGH药物中,后续可尝试通过评估其浓度变化规律考察其用于兴奋剂筛查工作的可能性。