电化学DNA生物传感构筑新方法及性能研究

作     者：屈登峰 

作者单位：烟台大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘树峰

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 080202[工学-机械电子工程] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 0802[工学-机械工程] 

主      题：熵驱动靶标循环 Toehold介导的链置换反应 电化学DNA传感器 DNA walker 催化发夹组装 

摘      要：发展简单、快速、灵敏度高及选择性好的核酸传感检测方法是生化分析、疾病诊断、环境监测等领域的迫切需求。电化学分析具有成本低、检测方便、灵敏度高等诸多优势。本论文致力于发展高灵敏电化学DNA传感分析新方法,基于不同DNA组装策略及信号放大技术（如立足点介导的链置换、熵驱动靶标循环、催化发夹DNA组装、DNA walker等）,构筑了三种不同类型电化学DNA生物传感器,实现了对靶标DNA及尿嘧啶-DNA糖基酶（UDG）的快速高灵敏检测。具体内容包括: 1.基于熵驱动靶标循环、Lambda核酸外切酶特异性切割及原位沉积银的电化学氧化检测技术,建立了一种新型DNA电化学生物传感器。将5’-端标记有磷酸基团的单链DNA（称之为燃料DNA）固定在电极表面上。待测溶液中引入三链体DNA组装探针,该三链体DNA是由三条单链DNA链组装而成,且含有靶标DNA识别的立足点（Toehold）。该DNA组装探针在靶标DNA的作用下,通过连续的立足点介导链置换反应,实现靶标循环信号放大（熵驱动靶标循环）,将传感界面上固定的单链DNA转变为大量的双链DNA;形成双链DNA后,标记的磷酸基团可引发Lambda外切酶特异性识别切割及循环放大,将传感界面上的DNA消解。结合DNA链上原位沉积银及电化学氧化检测技术,可实现对靶标DNA的两种响应模式检测（有和无Lambda外切酶）。针对靶标DNA的检测限分别为13.41f M（无Lambda外切酶时）和8.47 f M（有Lambda外切酶时）,实现了靶标DNA的准确高灵敏分析检测。 2.基于DNA walker策略,发展了一种DNA纳米机器信号转导及放大技术,并结合DNAzyme循环切割手段,构建得到一种新型电化学DNA传感器,实现了尿嘧啶-DNA糖基酶（UDG）活性的高灵敏检测。电极表面固定Mg-DNAzyme的底物DNA链,具有茎环结构,且标记有亚甲基蓝,用于电化学信号输出。DNA纳米机器是基于双足DNA walker驱动的催化DNA发夹组装操作实现。设计三个茎环DNA序列,其中一个茎环DNA含有尿嘧啶碱基,其可在UDG作用下脱去尿嘧啶碱基,并进一步在特异性内切酶（APE1）的切割作用下,实现链断裂,从而形成双足DNA walker的行走链。其进一步催化另外两个发夹DNA在金纳米颗粒表面组装（其中一条茎环DNA固定在纳米颗粒表面上）,实现纳米金颗粒表面上UDG驱动的双足DNA walker操作,同时在纳米金颗粒表面上形成了组装型DNAzyme序列,其可催化切割电极表面上的DNAzyme底物链,实现电化学信号响应。该策略巧妙结合了纳米金颗粒表面上的双足DNA walker及电极表面上DNA纳米机器的多足walker原理,加快了反应速度,同时显著提高了检测灵敏度,针对UDG的检测限可达4.3×10 U/m L。该研究为DNA纳米机器及生物传感构筑提供了一种新途径。 3.本章基于三发夹DNA催化组装策略,发展得到了一种自增强型电化学DNA walker传感检测技术,实现了DNA片段的高灵敏分析检测。设计三个具有茎环结构的DNA,其中一个发夹DNA固定在电极表面上,另一个发夹DNA标记有亚甲基蓝,用于信号输出。这三个发夹DNA可在目标DNA片段作用下,进行级联组装,同时目标DNA片段可循环利用,实现信号放大。电极表面形成的DNA组装体（Y-型结构）,其中一端形成目标DNA的类似物,作用与目标DNA片段类似。其可与电极表面上邻近的发夹DNA继续作用,触发三发夹DNA催化组装,形成级联的DNA walker操作。这种自增强型DNA walker传感检测技术具有操作简单、快速且检测灵敏度高等优势,针对目标DNA片段的检测限可达5.33 f M。该研究为构筑自增强型DNA传感检测技术提供了一种新思路。