油莎豆溶血磷脂酸酰基转移酶基因（CeLPATs）的鉴定及功能分析
作者单位：山西农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：季春丽
授予年度：2023年
主 题：油莎豆 溶血磷脂酸酰基转移酶 基因克隆 功能鉴定 低磷和低温胁迫
摘 要：油莎豆（Cyperus esculentus L.）适应性强、抗逆性高、病虫害少、产量和经济效益高,是目前唯一发现的一种在地下营养器官块茎大量积累油脂的特色油料作物。然而,油莎豆块茎油脂合成和积累以及抗逆性的分子机制仍不清楚。挖掘油莎豆富油和抗逆性关键基因可为解析植物营养器官油脂合成调控机制和植物胁迫应答机制提供新的科学依据,亦可为油莎豆等油料作物油脂和抗逆性遗传改良提供优异基因资源。本文以催化三酰基甘油（Triacylglycerol,TAG）合成的关键酶即溶血磷脂酸酰基转移酶（Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT）为切入点,系统解析油莎豆Ce LPAT参与TAG合成、膜脂重塑以及介导低温低磷胁迫响应的生物学功能。主要研究结果如下:1.以拟南芥At LPATs蛋白序列为索引,用Bio Edit软件对油莎豆转录组数据库进行本地BLAST检索,获得三条油莎豆Ce LPAT基因序列,根据系统进化树结果将其命名为Ce LPAT1、Ce LPAT2、和Ce LPAT5。2.生物信息学分析表明,三个Ce LPATs均有完整的ORF,编码蛋白为不稳定碱性疏水性蛋白、具有催化位点NH（X）D基序和酰基受体结合位点EGT基序。3.实时荧光定量分析显示,Ce LPAT基因在不同组织中均有表达,但不同基因表达水平存在显著差异。其中Ce LPAT2在块茎中表达远高于其他Ce LPAT基因,且在块茎发育过程中的表达模式与油莎豆块茎油脂积累动态变化相一致,预示着油莎豆Ce LPAT2与其他Ce LPAT基因的功能不同,可能是参与油莎豆块茎油脂合成和积累的关键基因。因此,本文选取在块茎中高表达的Ce LPAT2基因进行后续研究。4.大肠杆菌LPAT突变株SM2-1菌株功能互补测试表明,过表达Ce LPAT2的SM2-1菌株在42℃条件下能正常生长,而转空载体的SM2-1菌株在42℃下死亡。因此,Ce LPAT2蛋白具有酰基转移酶活性,可使大肠杆菌LPAT突变株恢复膜脂物质的合成。5.异源过表达Ce LPAT2显著促进酵母油脂合成。与野生型酿酒酵母INVSc1相比,转基因酵母总脂肪酸含量增加了5.3%,饱和脂肪酸（C16:0和C18:0）含量降低而单不饱和脂肪酸（C16:1和C18:1）含量增加,其中油酸（C18:1）含量增加了8.65%。这表明油莎豆Ce LPAT2酶活性较强,且对油酸（C18:1）有较高的底物偏好性。\6.普通烟草遗传转化测试发现,与转空载的普通烟草相比,过表达Ce LPAT2的转基因烟草叶片油脂含量增加3.1%、油酸（C18:1）含量增加了10.33%、淀粉含量降低7.49%、可溶性糖含量升高7.07%,蛋白质含量基本不变,其他农艺性状未现负效应。转基因烟草种子重量和千粒重分别增加15.15%和3.45%。这说明Ce LPAT2作为油脂代谢工程的优异靶基因,不仅可用于提高植物营养器官油脂和油酸的富集,而且还可用于种子油脂品质和产量的遗传改良。7.油莎豆幼苗和转Ce LPAT2基因烟草株系低磷和低温胁迫试验揭示,低磷和低温胁迫可上调Ce LPAT2基因表达,引起油莎豆块茎不饱和脂肪酸和磷脂含量增加,细胞膜脂发生重塑。转Ce LPAT2基因烟草株系膜脂抗氧化水平、抗氧化酶活性和抗氧化物质显著增加,低温和低磷胁迫下受害症状较轻。这表明Ce LPAT2可通过调节细胞膜脂稳态介导基因参与植物胁迫响应,过表达Ce LPAT2在不同程度上减轻烟草抵抗低磷和低温胁迫造成的损伤,可以提高了宿主对低磷和低温胁迫的抗性。本文从特色油料作物油莎豆中鉴定并克隆了在块茎中高表达的Ce LPAT2基因,验证Ce LPAT2的酰基转移酶活性和底物偏好性。过表达Ce LPAT2显著增加酿酒酵母和烟草叶片中油脂和油酸含量、烟草种子重量和含油量,增强宿主在低磷和低温胁迫下的抗性。为解析植物营养器官油脂合成机制及调控网络的研究提供新的科学依据,为继续改良其他营养器官富油物种的品质提供了新方向,为提高油莎豆块茎及其他油料作物油脂产量的遗传改良提供优异基因资源。
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