醛脱氢酶的挖掘、表征及其在糠醛氧化中的应用

作     者：沙江涛 

作者单位：华南理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李宁

授予年度：2023年

学科分类：081702[工学-化学工艺] 081705[工学-工业催化] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 080502[工学-材料学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 

主      题：醛脱氢酶 生物基呋喃 酶学性质表征 光/生物催化 生物基化学品 

摘      要：利用可再生、且碳中性的生物质资源生产化学品、能源及材料是解决当前化石资源过度使用带来的资源与环境危机的重要途径之一。糠醛（Furfural,FUR）是生物质炼制过程中的一个重要平台化合物,可以由半纤维素经过水解/脱水制得。FUR可以高值转化为糠酸（2-Furancarboxylic acid,FCA）和多种C4化合物,这些化合物在高分子、精细化学品以及燃料等领域具有广阔的应用前景。5-羟基-2（5H）呋喃酮(5-hydroxy-2（5H）-furanone,HFO)是FUR高值转化为C4化合物的一个关键中间体,可通过光催化氧化FUR或FCA制得。化学催化氧化FUR合成FCA及HFO已取得了重大进展,但仍存在反应条件苛刻、选择性不佳、需要使用有机溶剂或金属催化剂等缺点。生物催化不仅能有效克服上述问题,而且由于反应条件温和,故在合成路径上具有很好的延展性,可以与光催化/电催化等结合,进一步拓展产物链。醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase,ALDHs）是生物催化FUR氧化的一个重要催化剂,然而已报道的醛脱氢酶存在体外稳定性差、活性低等问题。鉴于此研究背景,本论文进行了新的ALDHs的发掘、酶学性质及相关应用研究,主要结果如下:1.新的ALDH发掘及酶学性质表征。本文在序列比对的基础之上,对NCBI数据库中的ALDHs分析、筛选,在Pseudomonas aeruginosa CICC 21100中发现了一种在中性条件下储存稳定性高、对芳香醛有高活力、且在*** BL21（DE3）中可溶性表达好的NADP依赖型对羟基苯甲醛脱氢酶（NADP-Pa HBDH）。其最适反应温度为55℃,但在该温度下稳定性较差,在20-30℃更稳定;最适p H为9,但在p H 6-7下更稳定。Pa HBDH对大部分有机溶剂具有较好的耐受性,但三氯甲烷与四氢呋喃易使酶快速失活。K、Ca与Mg等阳离子对Pa HBDH有激活作用,但Ni、Cu及Zn易使酶失活。Pa HBDH具有优异的贮存稳定性,在p H 7、4℃下保存一个月酶活损失低于10%。Pa HBDH对多种芳香醛表现出高活性,然而其对于5-甲酰基-2-糠酸(FFCA,合成2,5-呋喃二羧酸（FDCA）的前体)及其类似物4-甲酰基苯甲酸没有催化活性。Pa HBDH对FUR和NADP的k/K值分别约为25和507 smmol L。Pa HBDH对FUR的比活力最高达49 U/mg,远高于已报道的ALDHs的比活。*** HBDH在催化氧化FUR中的应用。重组菌***-Pa HBDH催化氧化FUR合成FCA的最佳反应温度和缓冲液分别为30℃及KHPO-Na OH缓冲液（200 mmol/L,p H 7.0）。在最适条件下,该重组菌能在16 h内能将100 mmol/L FUR基本完全转化,FCA选择性约为92%。在光/细胞一锅同步催化氧化FUR合成HFO中,我们发现光催化与全细胞催化间存在相互影响。光催化会导致重组菌失活,而细胞的存在降低了反应体系的透光性,导致光催化效率降低。基于Pa HBDH纯酶,我们成功构建了光/酶一锅同步催化氧化FUR合成HFO的体系。反应6 h后HFO产率达96%。Pa HBDH对HFO表现出较低的杂合性酯酶活性,约为2.9 m U/mg。总之,我们成功挖掘得到一种体外稳定,且对呋喃醛具有较高活性的醛脱氢酶,并证明了其在催化氧化FUR中的实用性。本研究不仅为生物催化领域提供了一个新的催化工具,而且为生物基呋喃的高值化转化奠定了一定的基础。