ABCC1通过抑制脑微血管内皮糖萼降解保护脓毒症小鼠血脑屏障的机制研究

作     者：张诗荧 

作者单位：华南理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾红科

授予年度：2023年

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：脓毒症 血脑屏障 内皮糖萼 ABCC1 1-磷酸鞘磷脂 

摘      要：目的:本研究拟证实脓毒症诱导脑微血管内皮糖萼降解及血脑屏障(BBB)通透性增加;明确脓毒症小鼠ATP结合盒亚家族成员1(ABCC1)表达情况变化,并探究其对脑微血管内皮糖萼及BBB的作用和机制。方法:本研究通过盲肠结扎穿孔(CLP)构建脓毒症小鼠模型,100 ng/ml脂多糖(LPS)干预脑微血管内皮细胞6 h模拟体外脓毒症损伤。CLP模型建立24 h后沿小鼠尾静脉注射伊文思蓝(2%EB,5 mg/kg)或荧光素钠(2%Na FL,5 mg/kg),观察EB和Na FL在脑组织中的渗漏情况,以对比CLP组和假手术组(Sham)小鼠BBB的通透性。体内/外实验中均通过免疫荧光和Western blot检测脑微血管内皮糖萼主要成分syndecan-1、ABCC1以观察脓毒症期间脑微血管内皮糖萼及ABCC1的蛋白表达水平的变化。随后,在体外使用si RNA转染敲低脑微血管内皮细胞ABCC1表达,PCR和Western blot分别检测ABCC1基因m RNA及蛋白表达水平,验证敲低效率;将细胞分为Con(Control)组、LPS组、NC+LPS(Negative control+LPS)组和si+LPS(ABCC1si+LPS)组,LPS干预6 h后,Western blot检测各组脑微血管内皮细胞syndecan-1表达水平,分析ABCC1对LPS诱发的内皮糖萼降解的抑制作用;并通过transwell培养单层脑微血管内皮细胞,酶标仪检测下室FITC-葡聚糖含量,验证ABCC1对LPS引起BBB通透性增加的抑制作用。为进一步探讨ABCC1作用于脑微血管内皮糖萼的具体分子机制,ELISA检测细胞上清中S1P浓度,明确LPS干预后ABCC1促进脑微血管内皮细胞向外排出S1P;并使用1μM 1-磷酸鞘氨醇(S1P)干预LPS处理的脑微血管内皮细胞,Western blot检测syndecan-1以及PI3K/Akt通路分子的表达情况。结果:与Sham组比较,CLP组小鼠脑组织中EB及Na FL含量显著增多;细胞/动物实验中免疫荧光和Western blot结果均显示脓毒症时脑微血管内皮细胞syndecan-1水平显著下降,ABCC1表达明显上升。使用si RNA转染成功敲低脑微血管内皮细胞ABCC1基因,LPS干预后细胞中syndecan-1的表达进一步下降;同时于transwell模型中,LPS干预后下室FITC-葡聚糖含量显著增多;相较于LPS组,si+LPS组模型下室FITC-葡聚糖含量进一步增加。ELISA结果显示LPS干预可增加细胞上清中S1P浓度,而ABCC1敲低后细胞上清S1P浓度显著降低;使用S1P干预ABCC1敲低的脑微血管内皮细胞后,syndecan-1含量增多,伴随PI3K、Akt磷酸化水平升高。结论:脓毒症可引起脑微血管内皮糖萼降解及BBB通透性增加;而ABCC1在脓毒症期间表达上调,促使脑微血管内皮细胞排出S1P,可通过激活PI3K/Akt通路抑制脑微血管内皮糖萼降解,从而减轻脓毒症导致的BBB通透性升高。