沉默Rad51对人胃肠道间质瘤细胞辐射敏感性的影响及机制研究

作     者：郑云峰 

作者单位：福建医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周永建

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胃肠道间质瘤 Rad51 同源重组修复 电离辐射 

摘      要：目的:胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤。过去的传统治疗观念普遍认为GIST对放射治疗不敏感,在目前治疗指南中仅推荐用于缓解症状和骨转移的姑息治疗。近年来,越来越多的病例报告和回顾性临床研究表明放射治疗可以部分控制或延缓晚期GIST疾病进展。然而放射抵抗及其不良反应在部分程度上限制了放疗在GIST病例中的广泛应用。因此,深入探究放射增敏的潜在机制,寻找GIST放射增敏新靶点为GIST多学科综合治疗提供新思路。Rad51(Recombination protein A,Rad51)是DNA双链断裂修复的关键因子,在同源重组修复(HRR,Homologous recombination repair)中扮演着主要角色,参与搜寻同源部位的DNA配对与链交换过程。已有研究证实Rad51基因突变在多种肿瘤发生、增殖、耐药、侵袭与转移中发挥着重要的作用。然而,Rad51在胃肠道间质瘤放射治疗中的作用及机制尚未完全阐明。在本研究中,我们将探讨DNA双链断裂修复基因Rad51对人胃肠道间质瘤细胞放射敏感性的影响与相关机制。方法:1.从Gene Expression Omnibus数据库下载GIST相关数据,并分析Rad51在GIST和正常组织中的差异表达情况。2.采用Western blot检测0、10、20、40Gy辐射剂量下细胞中Rad51蛋白表达情况。3.应用sh RNA干扰技术以慢病毒为载体构建稳转敲低细胞株GIST882并通过RT-q PCR、Western blot验证干扰效率。4.将细胞分为sh RNA-NC组、sh RNA-Rad51组分别给予0、10 Gy剂量的γ射线照射后,通过检测肿瘤细胞的增殖、克隆形成率、迁移与侵袭、细胞周期与凋亡等实验方法分析其放射增敏效果;5.采用Western blot、细胞免疫荧光实验分别检测Rad51表达变化对放射前后周期与凋亡相关蛋白及DNA损伤标志蛋白表达水平的影响。6.通过Western blot检测甲磺酸伊马替尼对Rad51表达水平的影响,通过体外实验探究甲磺酸伊马替尼与电离辐射的协同作用。7.实验统计学方法:采用SPSS 24.0软件进行统计学分析,所得数据采用均数±标准差(x±s)的方式表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析,当P0.05认为差异具有统计学意义。结果:1.胃肠道间质瘤中Rad51表达水平明显高于正常瘤旁组织。2.胃肠道间质瘤GIST882细胞在经γ射线照射后,Rad51蛋白表达水平随着辐射剂量的增加逐渐增高呈剂量依赖性,当超过40Gy时,Rad51表达量显著下降。3.以慢病毒为载体成功构建靶向敲减Rad51的GIST882细胞模型,RT-q PCR和Western blot实验证实稳转敲减细胞中Rad51表达水平明显低于阴性对照组。这些结果证明成功获得了敲减Rad51的稳转细胞模型,可用于后续实验。4.细胞功能学实验结果显示,敲减Rad51显著抑制照射后GIST882细胞的增殖、侵袭和迁移能力;并促进细胞凋亡和诱导细胞周期阻滞在G2/M期,增强细胞放射敏感性。5.沉默Rad51促进G2/M期相关蛋白Cyclin B1和抑制G0/G1期相关蛋白p21表达,减少抗凋亡蛋白Bcl-2表达,并使促凋亡蛋白Bax和γ-H2A.X蛋白表达水平显著提高,提示沉默同源重组修复蛋白Rad51通过促进G2/M期阻滞,细胞凋亡和DNA损伤,发挥辐射增敏作用。6.进一步探究甲磺酸伊马替尼与电离辐射间协同作用的潜在机制,本研究揭示了甲磺酸伊马替尼通过抑制GIST882细胞中Rad51表达水平,进而增强GIST的放疗效果。结论:***51在胃肠道间质瘤组织中表达较瘤旁组织显著上调。***51与胃肠道间质瘤放疗抵抗之间关系密切,有望成为预测GIST放疗敏感性与开发放射增敏剂的新靶标。3.敲减Rad51可以显著抑制照射后GIST细胞增殖和促进G2/M期阻滞,加重辐射诱导的DNA损伤和凋亡,进而发挥辐射增敏作用。4.甲磺酸伊马替尼通过降低GIST882细胞中Rad51表达发挥放射增敏作用。