miR-125b靶向TLE3调控猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的研究

作     者：安家岐 

作者单位：山西农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李步高;蔡春波

授予年度：2023年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：猪 miR-125b SMSCs RNA测序 增殖 分化 

摘      要：中国地方品种猪的现存数量较少,个体价值比较高,通过屠宰采集骨骼肌样品较为困难,因此活体采集猪骨骼肌样品能够降低成本,减少浪费。miRNA是长度约为18-24 nt的短链非编码RNA,可以靶向结合m RNA,进而调控细胞炎症因子和成肌分化因子等相关基因的表达,参与骨骼肌再生和成熟过程。本试验选取8头90日龄健康去势晋汾白猪公猪,随机分为两组。一组直接屠宰采集背最长肌(JFW＿90d组),另一组麻醉后活体采集背最长肌(JFW＿MI组),伤口消毒后缝合;10 d后,相同部位再次活体采集背最长肌样品(JFW＿R＿10d组)。三组样品进行miRNA和m RNA测序,并进行生物信息学联合分析,筛选调控猪骨骼肌再生和成熟的关键miRNA(miR-125b);通过生物信息学预测miR-125b的靶基因TLE3及其结合位点;采用q RT-PCR探究miR-125b和TLE3的表达模式;构建TLE3野生型(WT)和突变型(MUT)载体,双荧光素酶报告试验验证miR-125b和TLE3的靶向关系;猪骨骼肌原代卫星细胞(SMSCs)中分别改变miR-125b和TLE3的表达量,通过q RT-PCR、Ed U、免疫荧光等试验,探究miR-125b和TLE3对猪SMSCs增殖和成肌分化的调控作用。主要结果如下:(1)miRNA测序共检测到470个miRNA,其中117个为新miRNAs。JFW＿R＿10d和JFW＿90d组相比,有29个差异表达的miRNAs;JFW＿R＿10d和JFW＿MI组相比,有10个差异表达的miRNAs。m RNA测序共得到5806个差异表达的m RNAs。JFW＿R＿10d和JFW＿90d组相比,有3088个差异表达的m RNAs;JFW＿R＿10d和JFW＿MI组相比,有2899个差异表达的m RNAs。(2)q RT-PCR结果显示,JFW＿R＿10d组miR-125b的表达量显著低于JFW＿MI和JFW＿90d组,而TLE3的表达量高于JFW＿MI和JFW＿90d组。miR-125b和TLE3在背最长肌中的表达量均较高。双荧光素酶活性报告试验结果显示,miR-125b可以与TLE3的3′UTR端靶向结合。(3)猪SMSCs中转染miR-125b mimics,与NC组相比,增殖相关基因的表达量显著降低,Ed U阳性细胞数明显减少,TLE3的表达量显著降低;诱导成肌分化后,成肌分化相关基因的表达量显著升高,肌管数目增加。转染miR-125b inhibitor后,结果相反。(4)猪SMSCs成肌诱导分化过程中,TLE3表达量逐渐升高;猪SMSCs中转染TLE3过表达载体(OE-TLE3),与对照组(OE-NC)组相比,增殖相关基因的表达量显著升高,Ed U阳性细胞数明显增加;诱导成肌分化后,成肌分化相关基因的表达量显著降低,肌管数目降低。转染TLE3小干扰RNA(si-TLE3),出现相反结果。综上所述,miR-125b通过靶向TLE3抑制猪SMSCs的增殖,促进成肌分化。该研究阐明了miR-125b/TLE3调控猪SMSCs增殖和成肌分化的分子机制,填补了miR-125b在猪骨骼肌生长发育和再生研究中的空白,为猪的遗传选育提供新的靶点。