百合转录因子LoMYB33和LoMYB65调控花粉发育功能研究
作者单位：南京农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：滕年军
授予年度：2022年
学科分类：090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 09[农学]
摘 要：百合（Lilium spp.）是世界著名花卉,观赏和经济价值极高。然而,百合的花粉污染十分严重,花粉污染会降低百合花的观赏价值,是百合产业中亟待解决的关键问题,开展百合花粉发育研究将为无花粉百合育种提供理论依据。GAMYBs是一类R2R3-MYB转录因子,在植物生殖发育和生物抗性中发挥重要作用。然而,它们在百合中的功能和调节作用仍不清楚。在本学位论文中,作者在实验室良好研究基础上,从花粉发育的差异表达库中筛选出2个GAMYB家族基因,在东方百合杂种系‘西伯利亚’中进行克隆,并对这2个基因调控花粉发育的功能进行了研究。主要研究结果和结论如下:（1）LoMYB33的开放阅读框为1620 bp,编码一个539个氨基酸的蛋白质。LoMYB33属于GAMYB家族,具有R2R3结构域和三个BOX基序,与At MYB33亲缘关系最近。LoMYB33定位在细胞核和细胞质,具有转录激活活性,其反式激活结构域位于C端90个氨基酸内。LoMYB33在成熟花粉中高表达,且表达受赤霉素（GA）诱导,其启动子在花药发育后期被激活。利用VIGS技术在百合中沉默LoMYB33,发现百合花形没有明显变化,但花粉量显著减少,平均只有对照的41.6±10.6%。利用花序浸染法将LoMYB33异源转化拟南芥,发现转基因植株的花粉量显著降低,其中OE1的花粉量只有野生型的5.3±5.3%,OE2和OE5分别是野生型的35.3±35.5%和51.2±23.2%。进一步分析发现,转基因拟南芥的花药在四分体发育异常,主要表现为绒毡层提前降解,引起花粉败育。（2）LoMYB65包括一个2142 bp的开放阅读框,编码714个氨基酸的蛋白质。LoMYB65与At MYB65亲缘关系,属于GAMYB家族,具有R2R3结构域和三个BOX基序。LoMYB65的蛋白序列与LoMYB33差异较大,LoMYB65的BOX1到BOX2间隔为164氨基酸,长于LoMYB33,LoMYB33和LoMYB65的氨基酸相似性只有27.2%。LoMYB65同样定位在细胞核和细胞质,且具有转录激活活性,LoMYB65反式激活结构域位于C端226个氨基酸内。LoMYB65在花粉发育过程中表现出连续但波动的表达,在四分体阶段的小孢子中表达最高。LoMYB65启动子在第5阶段的花药及之后的成熟的花粉粒中被高度激活。在百合中沉默LoMYB65,发现沉默植株的花粉量是对照的50.9±17.0%,双沉默LoMYB33和LoMYB65的百合的花粉量是对照的46.1±13.7%。在拟南芥中过表达LoMYB65,发现OE3、OE5和OE6的花粉量分别只有野生型的22.5±2.7%、22.8±3.4%和22.5±3%。细胞学研究发现,转基因拟南芥的小孢子被胼胝质包裹,导致花粉发育异常,最终引起花粉败育。综上,本研究挖掘到了2个GAMYB家族基因LoMYB33和LoMYB65,并对它们在调控花粉发育中的功能进行了解析,LoMYB33在花药发育后期高表达,LoMYB65在整个发育过程中表现出连续但波动的表达。LoMYB33和LoMYB65可能通过影响绒毡层发育参与花粉发育。LoMYB33和LoMYB65都参与GA途径,但具体作用机制有待深入研究。结果不仅丰富了植物生殖生物学理论知识,更为重要的是将为无花粉百合分子设计育种提供科学依据和基因储备。
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